响应面优化低共熔溶剂提取乌龙茶多糖的研究

黄秀红，刘丽辰，阮怿航，程博思，林金科，2，*

（1.福建农林大学园艺学院，福建福州350002；2.福建农林大学安溪茶学院，福建福州350002）

茶多糖在降血糖、抗炎、抗凝、抗血栓、抗辐射、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、免疫刺激和抗病毒活性等方面发挥着重要的生物活性作用[1-4]。茶多糖作为功能性食品中的天然产品具有很大的潜在应用，广泛应用于食品、医药、保健等领域[5-7]。在六大茶类中，乌龙茶中的茶多糖含量较高。

茶多糖的主要提取方法有水提取法、微生物提取法、酶提取法、微波辅助提取法、超声波辅助法、超临界CO2提取法、反胶束技术提取法等[8-13]。传统的提取方法，由于存在提取率低、时间长等不足，较难以满足产业发展的需求。有机溶剂液液萃取需要使用多种有机溶剂，且有机溶剂的用量大，工序比较烦琐，加热时间长，引起茶多糖的氧化损失比较大，使茶多糖的抗氧化活性降低。因此，研究绿色环保高效茶多糖的提取技术对提高茶多糖的提取效率和抗氧化活性具有重要意义。

低共熔溶剂（deep eutectic solvents，DESs）由于特定的性质被归类为一种离子液体，可以与单个或多个络合物结合。由于DESs独特的理化性质，目前在活性成分提取、分离和分析等方面得到应用。DESs具有低成本、时间短、易合成、生物可降解、高增溶、低毒性甚至非毒性等特点[14-16]。因此，本研究采用DESs，结合响应面优化方法，探索乌龙茶多糖的绿色环保高效提取技术，为乌龙茶资源综合利用提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

乌龙茶：福建惜缘茶叶有限公司；无水乙醇、重蒸苯酚、浓硫酸、乙酸乙酯、氯化胆碱、甜菜碱、1，3-丁二醇、水杨酸、双氧水：国药集团上海化学试剂有限公司，均为分析纯。AB-8树脂、D101树脂PHD500树脂：郑州勤实科技有限公司。

恒温水浴锅（HH-6）：国华电器有限公司；水浴摇床（MQS-30S）：旻泉仪器有限公司；电子天平（GL-124-1SCNsartorius）：上海精天电子仪器有限公司；可见分光光度计（721N）：上海精密科学仪器有限公司；电热恒温鼓风干燥箱（DHG-9123A）：上海齐欣科学仪器有限公司。

1.2 试验方法

1.2.1 DESs的制备

参照XIA等[17]合成方法，不同氢键供体和氢键受体按照一定的比例置于250 mL烧杯中，在80℃下加热搅拌，直至形成均匀的液体。DESs组成如表1所示。

表1 不同DESs溶剂种类的合成及其配比Table 1 Synthesis and ratio of different DESs solvent species

1.2.2 粗茶多糖的提取

将干燥的乌龙茶用高速粉碎机粉碎，过80目筛，放冰箱备用。精确称取2.00 g茶粉于离心管中，加入DESs12 mL，蒸馏水28 mL[（料液比1∶20（g/mL）]混合均匀，于60℃下恒温浸提，用抽滤机抽滤，再用高速离心机离心30 min（3500 r/min）取上清液，将上清液浓缩，加入5倍体积的无水乙醇，静置过夜，次日离心30 min（3 500 r/min）收集沉淀，分别用无水乙醇、乙酸乙酯洗涤沉淀，每次洗涤充分搅拌，以蒸馏水提取茶多糖方法作对照，将所有沉淀物溶于水，定容至250 mL容量瓶中。

1.2.3 茶多糖含量的测定

参照李涛[18]的方法进行。

1.2.4 单因素考察

以茶多糖得率为评价指标进行单因素试验，分别考察低共熔溶剂类型（DES-1、DES-2、DES-3、DES-4、DES-5、DES-6）、低共熔溶剂含水率（40%～100%）、固液比[1 ∶10（g/mL）～1 ∶50（g/mL）]、提取温度（40 ℃～80℃）、提取时间（20 min～100 min）对多糖得率的影响。

1.2.5 响应曲面方案设计

在单因素试验结果的基础上确定3个独立变量，包括提取时间、提取温度和含水率，运用响应面分析软件Box-Behnken，以多糖得率为响应值进行响应面试验分析，确定茶多糖提取最佳工艺条件。试验设计见表2。

表2 因素与水平Table 2 Factor and levels

1.2.6 多糖的纯化

1.2.6.1 大孔树脂的预处理、分析、筛选

根据马若影[19]的方法进行。

1.2.6.2 大孔树脂效果评价

按照蓝海波等[20]的方法进行。

1.2.7 茶多糖抗氧化的测定

1.2.7.1 DPPH自由基清除率的测定

根据冯丽琴[21]的方法进行。

1.2.7.2 对羟自由基清除率的测定

根据SMIRONFF等[22]的方法进行。

1.3 统计分析

所有的试验均平行重复3次，使用SPSS17.0和Design Expert8.0.6软件对数据进行统计分析。利用Design Expert8.0.6进行试验设计和试验数据的回归分析，其中p＜0.05具有显著性差异，p＜0.01具有极显著性差异。

2 结果与分析

2.1 低共熔溶剂和提取条件的筛选

2.1.1 不同DESs类型对茶多糖得率的影响

探讨6种DESs对茶多糖得率的影响，如图1所示。

图1 不同DESs类型对茶多糖得率的影响Fig.1 Effect of different DESs on the yield of tea polysaccharides

DES-6多糖得率最高，达到4.90%。考虑到提取得率，DES-6比其他DESs具有更好的性能，这可能是由于更高的氢键能力和DESs与多糖的多静电相互作用，且1，3-丁二醇的醇基分支少，内部空间大。因此，DES-6更适合茶多糖的提取。

2.1.2 DES-6含水率对茶多糖得率的影响

提取得率很大程度上取决于DESs溶液的含水率，结果如图2所示。

DES-6溶剂含水率在40%～80%时，多糖得率逐渐增加，在80%时达到最大值，DES-6溶剂含水率在80%～100%时，多糖得率逐渐减少。这主要是因为低含水率的DESs溶剂难以渗透到植物细胞中获得高提取率，而过高的含水率会增加混合物的极性，降低甜菜碱，1，3-丁二醇与多糖间的相互作用。

图2 不同含水率多茶多糖得率的影响Fig.2 Effect of yield of polysaccharides with different water content

2.1.3 DES-6提取温度对茶多糖得率的影响

提取温度是影响提取率的关键因素，结果如图3所示。

图3 不同温度对茶多糖得率的影响Fig.3 Effect of different temperatures on the yield of tea polysaccharides

多糖得率随着温度的升高而增加，在60℃达到最大值5.70%，之后随着温度的升高，多糖得率下降。虽然较高的温度会提高提取得率，但是可能无法承受多糖的热降解，导致多糖得率下降。因此，确定60℃为最佳提取温度。

2.1.4 DES-6固液比对茶多糖得率的影响

固液比是提高所需物质得率的重要因素，对得率具有重要影响，结果如图4所示。

随着溶质体积的增加，多糖得率增加，在1∶20（g/mL）时达到最大值5.68%。然而随着溶质体积的增加。多糖得率不断下降。其原因是少量的萃取溶剂很容易达到萃取平衡，这是目标化合物的不完全萃取。大量的萃取溶剂虽然会增加目标化合物的浸出率，但也会导致萃取溶剂的浪费和萃取过程的复杂化。因此，确定1∶20（g/mL）为最佳固液比。

图4 不同固液比对茶多糖得率的影响Fig.4 Effect of different solid-liquid ratio on the yield of tea polysaccharides

2.1.5 DES-6提取时间对茶多糖得率的影响

不同时间对茶多糖得率的影响见图5。

图5 不同时间对茶多糖得率的影响Fig.5 Effect of different time on the yield of tea polysaccharides

多糖得率随着时间的增加而增加，在80 min时达到最大值6.32%，之后随着时间的增加，多糖得率下降。其原因主要是因为在一段时间内，活性成分的溶出率会随着时间的增加而增加，然而达到一定时间后，溶液体系渗透压达到平衡时溶出率的变化不大[23]。因此，确定80 min为最佳提取时间。

2.2 响应面优化茶多糖提取技术

2.2.1 统计分析与模型拟合

在单因素试验的基础上，以乌龙茶多糖提取得率为考察响应值，根据响应面分析法中Box-Behnken Design的中心组合试验设计原理，以提取时间（A）、提取温度（B）、含水率（C）为自变量，设计三因素三水平共17个试验点的响应面分析试验设计及结果见表3。

表3 响应面分析试验条件及结果Table 3 Response surface experimental conditions and results

通过回归分析，得到乌龙茶多糖提取得率与提取时间（A）、提取温度（B）、含水率（C）的二次多项回归模型：

回归方程的各项方差分析见表4。

表4 响应面分析结果Table 4 Response surface analysis results

由回归模型的方差分析可知，模型的回归方程极显著（p＜0.000 1），说明该试验方法可靠。失拟项不显著（p=0.148 7＞0.05），说明回归方程能很好地解释结果并预测最佳条件。多元相关系数R2=0.983 9＞95%，可知因变量对自变量的影响显著，且模型方程拟合良好。校正决定系数R2adj=96.31%，说明响应值的96.31%是由于所选变量引起的。对各因素进行显著性检验，从表4可以看出，C对模型的影响极为显著（p＜0.01），A和B对模型的影响显著（p＜0.05）。由各因素的F值可知，三因素对茶多糖提取的影响显著性排序为：C（含水率）＞B（提取温度）＞A（提取时间）。

2.2.2 响应面分析

3D响应曲面图和2D响应等值线图提供了两个独立变量之间相互作用的直观解释。通过观察曲面的倾斜度确定两者对响应值的影响程度，倾斜度越高，即坡度越陡，说明两者交互作用越显著。提取时间（A）、提取温度（B）和含水率（C）对茶多糖得率的影响如图6。

图6 各因素相互作用对茶多糖得率影响的等值线和3D响应面Fig.6 Contour map and 3D response surface diagram of the effects of various factors on the yield of tea polysaccharides

C的响应曲面的倾斜度最高，说明C对茶多糖的得率的影响最大。该结果与表4方差分析结果一致（p＜0.01）。除AB和AC之间的交互曲面较平，其他均有较大的倾斜度，说明其他因素对茶多糖的影响较大。该结果与表 4 方差分析结果一致（p＜0.05）。图 6（c）和（f）的椭圆形相应等值线图显示了BC之间存在较显著的交互关系。

2.2.3 预测模型验证

通常需要检查拟合模型，确保它为实际系统提供足够的近似值。除非模型显示出足够的拟合，否则进行调整和优化拟合响应面可能会产生差的或误导性的结果。通过构建残差的正态概率图，检查正态性假设，如图7所示。

图7 残差的正态概率Fig.7 Normal plot of residual

图8 残差与预测响应的关系Fig.8 Relationship between residual and predicted response

由于残差曲线沿直线近似，因此满足了正态性假设。图8给出残差与方程预测值的对应关系图，残差在显示器上随机散射，表明原始观察的方差对于所有值都是恒定的。图7、图8所得到的结果都较符合模型，因此得出结论，预测模型足以描述响应面的提取得率。

使用Design-Expert软件，提取物的自变量和响应变量的最佳提取条件如下：提取时间（A）81.27 min，提取温度（B）61.45℃，含水率（C）83.73%，最大预测得率为6.84%。考虑到实际应用的方便，对3个因素试验值进行适当调整：A=81 min，B=61℃，C=84%，利用改进后的最优条件进行3次重复试验，茶多糖平均提取率为（6.91+0.21）%，与预测值无明显差异性（p＞0.05）。因此，该模型适用于茶多糖的优化。

2.3 茶多糖纯化

按照1.2.6的方法，用不同型号的树脂对乌龙茶多糖进行脱色脱蛋白处理，如图9所示。

图9 不同树脂加入量对多糖脱色脱蛋白的影响Fig.9 Effect of different resin addition on decolorization and decolorization of polysaccharides

同一树脂不同用量对多糖脱色除蛋白效果影响很大。弱极性树脂AB-8树脂在用量为0.8 g/mL时最好，非极性树脂D101树脂在用量为0.6 g/mL时最好，极性树脂PHD500树脂在0.2 g/mL时最好。3种树脂脱色脱蛋白效果对比见表5。

表5 3种树脂脱色脱蛋白效果对比Table 5 Comparison of decolorization and deproteinization effects of three kinds of resins

如表5可知，AB-8和PHD500的脱蛋白效果较好，但脱色率和多糖保留率相对较低。D101脱色率较好，多糖保留率较高，且综合评分较高。综合考虑，最终选用D101树脂进行下一步的多糖纯化试验。

2.4 茶多糖抗氧化活性能力

2.4.1 DPPH自由基清除活性

不同浓度茶多糖对DPPH自由基清除率的作用如图10所示。

图10 茶多糖对DPPH自由基清除能力Fig.10 Tea polysaccharides to DPPH free radical scavenging ability

从图10中可以看出，在样品浓度为0.04 mg/mL～0.2 mg/mL范围内，DES-6、水和VC对DPPH自由基的清除能力与多糖浓度呈正相关。当浓度为0.2 mg/mL时，DES-6提取多糖的DPPH自由基清除率（91.44±1.15）%，比常规水提多糖的清除率（59.44±2.45）%高。样品的IC50值越小，其抗氧化能力越强。DES-6的IC50为 0.073，水的 IC50为 0.158，VC的 IC50为0.092。DES-6的抗氧化能力最强，VC的抗氧化能力次之，水的抗氧化能力最弱。DES-6的抗氧化能力与水的抗氧化能力比相对提高了53.79%，DES-6的抗氧化能力相比VC的抗氧化能力相对提高了20.65%。可见，用DES-6提取的茶多糖对DPPH自由基的清除作用明显，并且随着多糖浓度的增加，清除能力增强，表明茶多糖对DPPH自由基的清除能力与其浓度具有明显的量效关系。

2.4.2 羟自由基清除活性

不同浓度茶多糖对羟自由基清除率的作用如图11所示。

图11 茶多糖对羟自由基清除能力Fig.11 Tea polysaccharides scavenging ability of hydroxyl radicals

从图11中可以看出，在样品浓度为0.1 mg/mL～0.5 mg/mL范围内，DES-6、水和VC对羟自由基的清除能力与多糖浓度呈正相关。当浓度为0.5 mg/mL时，DES-6提取多糖的DPPH清除率（87.77±1.71）%，比常规水提多糖的清除率（78.70±1.12）%高。DES-6的IC50为 0.196，水的 IC50为 0.291，VC的 IC50为 0.206。DES-6的抗氧化能力最强，VC的抗氧化能力次之，水的抗氧化能力最弱。DES-6的抗氧化能力与水的抗氧化能力相比提高了32.65%，DES-6的抗氧化能力与VC的抗氧化能力相比提高了5.10%。可见，用DES-6提取的茶多糖对羟自由基的清除作用明显，并且随着多糖浓度的增加，清除能力增强，表明茶多糖对羟自由基的清除能力与其浓度具有明显的量效关系。

3 结论

以响应面法来优化DESs提取条件，确定茶多糖的最佳提取方法。结果表明，由甜菜碱和1，3-丁二醇组成的低共熔溶剂最适合茶多糖的提取。通过评估不同操作参数对茶多糖提取的影响，确定提取的最佳工艺参数，得到最佳提取条件为提取时间81 min，提取温度 61℃，含水率 84%，固液比 1∶20（g/mL），茶多糖的得率可达到6.91%。比较3种树脂脱色脱蛋白的效果，并选用D101树脂对茶多糖进行初步纯化。采用DES-6提取的茶多糖有较强的DPPH自由基清除能力和羟自由基清除能力。因此具有绿色环保高效的低共熔溶剂作为提取介质，对提高茶多糖的提取得率和抗氧化活性具有重要意义。