还贝止咳方的提取纯化工艺的优化

张雯霞 冯 敏 苗雨露张文智倪 艳∗

（1.山西中医药大学，山西 太原030619； 2.山西省中医药研究院中药方剂研究所，山西省中药制剂成型实验室，山西 太原030012）

还贝止咳方是以现有治疗咳嗽变异性哮喘的研究成果为基础，结合临床经验所组成的治疗小儿咳嗽的经验方，由还阳参、平贝母、苦杏仁、紫苏子、黄芩、枳壳、乌梅、甘草等药材组成，临床上用于治疗咳嗽变异性哮喘、喘息性支气管炎等肺热咳嗽，具有清热肃肺、止咳平喘之功效。临床上还贝止咳方主要剂型为汤剂，但具有携带不便、不能长时间保存等缺点，为了适应临床需求，拟将其制成更为轻便的剂型。还贝止咳方药味较多，成分复杂，药效物质基础及作用机制尚未明确，为了确保制剂有效，本实验对将选取多个检测指标对其提取纯化工艺进行优化。

G1 法是对层次分析法进行改进后的赋权方法，它不需要构建判断矩阵和一致性检验，对指标个数没有限制，同时具有保序性［1］，近年来常与熵权法结合使用。熵权法最先由申农引入信息论，目前已在工程技术［2-3］、社会经济［4］等领域得到了非常广泛的应用，其基本思路是根据指标变异性的大小来确定客观权重。一般来说，若某个指标的熵值越小，则其变异程度越大，提供的信息量越多，在综合评价中所起到的作用和权重也越大；反之，若某个指标的熵值越大，则提供的信息量越少，其权重也越小。将G1 法和熵权法结合使用时，以主观、客观2 种评价方法结果的偏离程度最小为原则，通过分别求得两者权重比例，综合考虑了它们对组合权重的影响，可有效避免传统组合赋权评价方法的平均分配主客观权重、忽略主客观评价结果对权重影响的做法，从而对组合系数进行优化，同时兼顾主客观权重时可提高了数据合理性［5］。目前，G1-熵权法在中医药领域的应用鲜有报道，故本实验采用该方法和正交试验优化还贝止咳方提取纯化工艺，结合多个指标综合权重后的综合评分，以期筛选出该方最合理可行的工艺参数，为其进一步生产及应用奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 RE5298A 型旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂）；DZF-6050 型真空干燥箱（南京沃环科技实业有限公司）；LC-300B 型数控超声清洗机（山东济宁鲁超超声设备有限公司）；TU-1901 型双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）；Ultimate 3000 型高效液相色谱仪，配置ChromeleonTM（变色龙） 色谱工作站（美国戴安公司）；Hypersil SinoChrom ODS-BP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm，柱号E2615033，批号140325）；SE402F 型电子天平［奥豪斯仪器（上海） 有限公司］；BS223S 型电子天平（北京赛多利斯仪器系统有限公司）。

1.2 试药 还阳参采自山西省朔州市山阴县，经专家检验符合《山西省中药材中药饮片标准（第一册） 》 还阳参项下各项规定；平贝母、苦杏仁、黄芩、地龙、枳壳、紫苏子、僵蚕、桃仁、乌梅、甘草等药材均购自安徽省亳州市药材市场，由山西省中医院提供，经山西中医药研究院倪艳教授鉴定为正品，均符合2015 年版《中国药典》 一部中各药材项下要求。绿原酸（批号110753-200413）、黄芩苷（批号110715-201117 对照品） 购自中国食品药品检定研究院。乙醇（国药集团化学试剂有限公司）、磷酸（北京试剂有限公司）、甲醇（西陇化工股份有限公司） 为色谱纯；其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 绿原酸含有量测定［6］

2.1.1 色谱条件 Hypersil SinoChrom ODS-BP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相甲醇（A） -0.4%磷酸（B），梯度洗脱（0～10 min，25%～30%A；10～25 min，30%～33%A）；检测波长327 nm，进样量5 μL。理论塔板数按绿原酸峰计算，应不低于12 000。

2.1.2 供试品溶液制备 精密称取各工艺条件下制备的干膏粉约1 g，精密加入20 mL 甲醇，称定质量，超声30 min，放冷，甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，蒸干，残渣加甲醇复溶，定容至5 mL，即得。

2.1.3 对照品溶液制备 精密称取绿原酸对照品2.50 mg，加甲醇制成每1 mL 含0.1 mg 绿原酸的溶液，即得。

2.1.4 线性关系考察 精密量取对照品溶液0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇稀释至刻度，摇匀，得 到 0、10、20、30、40、50 μg／mL 溶 液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定。以峰面积为纵坐标（Y），对照品质量浓度为横坐标（X） 进行回归，得到方程为Y＝80.164X（R2＝0.999 2），在0～50 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.1.5 精密度试验 精密吸取供试品溶液5 μL，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定6 次，测得绿原酸峰面积RSD 为2.11%，表明仪器精密度良好。

2.1.6 重复性试验 取同一干膏粉6 份，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样5 μL 测定，测得绿原酸含有量RSD 为1.87%，表明该方法重复性良好。

2.1.7 稳定性试验 取干膏粉适量，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，于0、1、2、4、6、8、10、12 h 在“2.1.1” 项色谱条件下进样5 μL，测得绿原酸峰面积RSD为1.27%，表明供试品溶液在12 h 内稳定性良好。

2.1.8 加样回收率试验 精密称取绿原酸质量已知（0.145 0 mg） 的干膏粉约0.5 g，共9 份，加入对照品溶液（0.1 mg／mL） 0.725、0.725、0.725、1.450、1.450、1.450、2.175、2.175、2.175 mL，按“2.1.2” 项下方法制备供试品溶液，在“2.1.1” 项色谱条件下进样测定，计算回收率。结果，绿原酸平均加样回收率为101.45%，RSD 为1.76%。

2.2 总黄酮含有量测定［7］

2.2.1 对照品溶液制备 精密称取黄芩苷对照品1.95 mg，置于50 mL 量瓶中，60%乙醇超声1 min，放冷，60%乙醇定容至刻度，摇匀，即得（质量浓度39 μg／mL）。

2.2.2 供试品溶液制备 精密称取各工艺条件下制备的干膏粉约0.1 g，置于具塞锥形瓶中，精密加入20 mL 60%乙醇，密塞，称定质量，超声30 min，放冷，60% 乙醇补足减失的质量，摇匀，滤过，精密吸取续滤液1 mL，置于100 mL 量瓶中，60%乙醇定容至刻度，摇匀，即得。

2.2.3 检测条件 以黄芩苷为对照品，紫外-可见分光光度计在278 nm 波长处测定黄酮含有量。

2.2.4 线性关系考察 精密吸取对照品溶液0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3 mL，置于10 mL 量瓶中，60%乙醇定容至刻 度，摇 匀，得 到1.95、3.90、5.85、7.80、9.75、11.70 μg／mL 溶液，以空白试剂为参比测定吸光度。以吸光度为纵坐标（A），对照品质量浓度为横坐标（X） 进行回归，得到方程为A＝0.073 7X+0.008 1 （R2＝0.999 8），在1.95～11.70 μg／mL 范围内线性关系良好。

2.2.5 精密度试验精密称取干膏粉约0.1 g，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在278 nm 波长处测定吸光度6 次，测得总黄酮含有量RSD 为0.13%，表明仪器精密度良好。

2.2.6 重复性试验 取同一干膏粉6 份，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在278 nm 波长处测定吸光度，测得总黄酮含有量RSD 为1.41%，表明该方法重复性良好。

2.2.7 稳定性试验 取干膏粉适量，按“2.2.2” 项下方法制备供试品溶液，在278 nm 波长处每30 min 测定1 次吸光度，共2 h，测得总黄酮含有量RSD 为2.56%，表明溶液在2 h 内稳定性良好。

2.2.8 加样回收率试验 取总黄酮含有量（6.938 9 μg／mL）的供试品溶液9 份，每份10 mL，加入对照品溶液（70 μg／mL） 0.5、0.5、0.5、1.0、1.0、1.0、1.5、1.5、1.5 mL，摇匀，在278 nm 波长处测定吸光度，测得总黄酮平均加样回收率为100.01%，RSD 为1.79%。

2.3 评价指标的组合赋权

2.3.1 G1 法主观赋权［8］

2.3.1.1 评价指标间的序关系 如果评价指标x1、x2、…、xm相对于某评价准则具有关系式x1＞x2＞…＞xm，则称评价指标之间按照“＞” 确立了序关系。其中，xj表示｛xj｝ 按序关系“＞” 排定顺序后的第j个评价指标（j＝1、2、…、m）。

2.3.1.2 评价指标间相对重要关系及比较赋值 设决策者或专家关于评价指标间xj-1与xj的重要性程度之比为rj，即权重评价标度的理性判断为公式（1）。

2.3.1.3 评价指标间的相对权重 见式（2） 和（3）。

2.3.2 熵权法客观赋权［9］

2.3.2.1 第j个指标下第i 个对象的指标值比重Yij见式（4）。

2.3.2.2 第j项指标的熵值 见式（5）。

2.3.2.3 指标权重系数 见式（6）。

2.3.3 组合权重确定 设由G1 法得到的主观权重为w1，由熵权法得到的客观权重为w2，计算组合权重，见式（7）。

2.4 提取工艺优化 按照处方（76 g） 称取相应饮片，以总固体得率（干膏质量／对应处方药材质量）、总黄酮含有量（供试品中总黄酮质量／对应处方药材质量）、绿原酸含有量（供试品中绿原酸质量／对应处方药材质量） 为评价指标，提取时间（A）、提取次数（B）、加水量（C） 为影响因素，每个因素选择3 个水平，应用L9（34） 正交表进行试验。因素水平见表1。

表1 提取工艺因素水平

依据中药复方“君臣佐使” 的配伍原则及与功效相关的主要有效成分，根据G1 法确定各评价指标的顺序关系为总黄酮含有量＞总固体得率＝绿原酸含有量，同时确定各指标的权重评价标度r2＝1.3、r3＝1，求得各指标的主观权重值w1，采用熵权法计算各指标客观权重值w2，计算各指标的组合权重值w，最后计算的到各评价对象的综合评分Pi，见式（8），并进行直观分析和方差分析。各影响因素权重值见表2，结果见表3，方差分析见表4。

表2 提取工艺评价指标权重值

表3 提取工艺试验设计及结果

表4 提取工艺方差分析

由直观分析可知，各因素对综合评分的影响程度依次为B＞A＞C，而且B3＞B1＞B2，A3＞A2＞A1，C2＞C1＞C3；由方差分析可知，各因素对综合评分均无显著影响（P＞0.05）。为了最大限度的提取该方有效物质，保证临床疗效，故选取各影响因素较高水平的组合A3B3C2作为最优提取工艺，即加10 倍量水煎煮3 次，每次1.5 h。

然后，放大3 倍处方比例称取药材进行验证试验，结果见表5，可知该工艺稳定可行。

表5 提取工艺验证试验结果（n＝3）

2.5 纯化工艺优化 结合文献［10-11］ 及预实验结果，选择浸膏量（每1 mL 药液中的生药量）、乙醇体积分数［醇沉后药液中乙醇含有量，加醇量计算公式见式（9），其中V为加醇量，V1为醇沉前药液体积，C1为醇沉后药液中乙醇体积分数，C2为添加乙醇体积分数］、静置时间作为影响因素，每个因素选择3 个水平，以总固体得率及总黄酮、绿原酸含有量为评价指标，应用L9（34） 正交表进行试验。因素水平见表6。

表6 纯化工艺因素水平

采用G1-熵权组合赋权方法（序关系及权重评价标度同“2.4.1” 项） 对评价指标进行权重系数分配，由于纯化的目的是减少服用剂量，故总固体得率以低为佳，需将其转换为倒数后再进行计算，由式（8） 计算综合评分后进行直观分析和方差分析。各影响因素权重值见表7，结果见表8，方差分析见表9。

表7 纯化工艺评价指标权重值

表8 纯化工艺试验设计及结果

表9 纯化工艺方差分析

由直观分析可知，各因素对综合评分的影响程度依次为B＞A＞C，而且B1＞B2＞B3，A1＞A2＞A3，C2＞C1＞C3；由方差分析可知，因素A（浸膏量） 和C（静置时间） 对综合评分无显著影响（P＞0.05），而因素B（乙醇体积分数）对其有显著影响（P＜0.05）。因此，选取各影响因素较高水平的组合A1B1C2作为最优纯化工艺，即将浸膏浓缩为1 g／mL生药量，50%乙醇醇沉后静置24 h。

然后，放大3 倍处方比例称取药材进行验证试验，结果见表10，可知该工艺稳定可行。

表10 纯化工艺验证试验结果（n＝3）

3 讨论

中药复方发挥作用不是某种单一成分的独立效用，也不是各单味药药效作用的简单叠加，而是多种有效组分同时对机体的多个靶点通过多种途径综合作用的结果。还贝止咳方由11 味药材组成，成分复杂，如何在提取纯化工艺中最大限度保留有效成分并去除杂质为核心问题，也是该方后续研究的最基础问题。总固体得率对制剂成型有一定影响，可作为制剂日服量及包装规格确定的依据，同时也反映了提取溶剂对药材有效成分的浸出情况；方中黄芩、枳壳、桃仁等均含黄酮类成分［12-14］，具有抗菌、抗病毒、抗炎、抗过敏、免疫调节等作用，并且绿原酸也具有止咳、祛痰、抗菌、解毒等作用［15-16］，而且为君药还阳参的主要有效成分［17］。因此，本实验选择总固体得率及总黄酮、绿原酸含有量作为评价指标。

在筛选还贝止咳方最佳提取纯化工艺时，对评价指标进行权重是至关重要的一步，其合理性会直接影响最终实验结果。目前，对考察指标进行权重的方法可分为三大类［18］，即主观赋权法、客观赋权法、组合赋权法，其中主观赋权法是决策者根据自身经验对评价指标进行权重，虽然有一定参考价值，但也存在主观随意性的风险；客观赋权法是根据实际数据所反映的客观信息对评价指标进行权重，虽然应用了严谨的数学统计理论，但缺乏决策者的主观意图；本实验采用组合赋权法将两者进行线性组合，最终确定权重系数，可提高实验结论的客观性与合理性。G1法是专家通过判定某一指标的重要程度，按照一定原则实现对各指标的分值，然后根据计算定理确定各指标权重；熵权法仅利用客观信息进行计算，为G1 法提供了一个相对客观的指标间序关系，两者结合使用可使评价指标权重更加科学合理［19］。

课题组前期对高速离心法、壳聚糖絮凝法、乙醇沉淀法3 种纯化方法进行考察，发现壳聚糖絮凝后虽然出膏率偏低，但总黄酮、绿原酸含有量也大大降低，有效成分损失严重；高速离心法虽然操作简单，但药液总固体得率依然较高，药液澄清度也较差，而且可能存在除杂不彻底等问题；乙醇沉淀法虽然操作相对复杂，但可在保留有效成分的前提下大大降低总固体得率，从而更好地达到降低服用量要求，并且药液澄明度也更好（澄明度为口服液的重要质控指标，反映了产品的稳定性），可为该方后续剂型选择提供了更多可能性。综上所述，为了提高制剂质量，减少服用剂量，本实验选择乙醇沉淀法纯化还贝止咳方水提液。