石斛甲醇提取物HPLC-MS 分析及4 种多酚测定

贡小辉，朱益灵，魏 渊，孔令东，韩邦兴，欧阳 臻∗

（1.江苏大学药学院，江苏 镇江212013； 2.南京大学生命科学学院，江苏 南京210093； 3.皖西学院生物与制药工程学院，安徽 六安237012）

石斛属是兰科的一大属，我国有74 个种和2个变种，其中有50 多种被作为药用［1-2］。石斛药用始载于秦汉时期《神农本草经》，被列为上品［3］。2015 年版《中国药典》 收载有石斛与铁皮石斛，石斛为兰科植物金钗石斛Dendrobium nobileLindl.、鼓槌石斛Dendrobium chrysotoxumLindl.或流苏石斛Dendrobium fimbriatumHook.的栽培品及其同属植物近似种的新鲜或干燥茎，铁皮石斛为兰科植物铁皮石斛Dendrobium officinaleKimura et Migo 的干燥茎，具有益胃生津、滋阴清热的功效［4］。现代药理研究表明石斛具有保肝、调节免疫力［5］、抗白内障［6］和促进胃液释放［7］等生物活性，其主要活性成分为黄酮、酚酸、多糖、生物碱等［8-10］。已有文献报道黄酮和酚酸等多酚类成分在石斛的传统药效“厚肠胃，轻身延年” 方面具有显著疗效。Ekambaram G 等［11］对大鼠体内N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍诱导的胃癌研究表明，柚皮素对胃癌具有有效的保护和治疗作用。刁红星等［12］研究发现石斛酚与丁香酸协和具有抗白内障和肝保护的作用。黄丹丹等［13］对金钗石斛黄酮类成分活性研究表明，芦丁具有抗氧化作用。

石斛来源众多，分布较广。现有文献报道及课题组前期研究发现不同品种、不同产地石斛，其化学成分和药理作用均有差异［14-17］。因此，本实验采用HPLC-MS 法对石斛甲醇提取物的化学成分进行定性分析；建立HPLC 法同时测定石斛中丁香酸、氧化白藜芦醇、芦丁和柚皮素的含有量，并比较不同品种、产地石斛中多酚类成分的含有量差异，以期为其质量控制和临床应用提供依据。

1 材料

1.1 仪器 高效液相-线性离子阱质谱（FinniganTMLXQTM液质联用仪，美国赛默飞世尔科技公司）；安捷伦1260 高效液相色谱仪（美国安捷伦公司）；FA1204B 分析天平（上海精科-上海天平仪器厂）；BuchiR-200 型旋转蒸发仪（瑞士Buchi 公司）。

1.2 材料 对照品氧化白藜芦醇（CAS29700-22-9，成都麦德生科技有限公司）；丁香酸（CAS530-57-4）、芦丁（CAS153-18-4） （四川维克奋生物科技有限公司）；柚皮素（CAS480-41-1） （上海跃腾生物技术有限公司）。甲醇为色谱纯，其余试剂为分析纯。河南石斛、铁皮石斛、铜皮石斛和霍山石斛9 批样品采自安徽省六安市霍山县，其他10 批石斛分别采自江苏、浙江、云南、江西等产地，由江苏大学欧阳臻教授鉴定为正品。信息见表1。

表1 样品信息Tab.1 Information of samples

2 方法与结果

2.1 供试品溶液制备 取样品粉末1 g，精密称定，加甲醇20 mL，70 ℃加热回流提取1 次，提取时间2 h，滤过，滤液减压蒸干，残渣加甲醇使之溶解，并定容至5 mL，过0.45 μm 微孔滤膜，即得。

2.2 对照品溶液制备 精密称取各对照品适量，加甲醇制成每1 mL 含丁香酸8.54 μg、氧化白藜芦醇40.03 μg、芦丁40.00 μg、柚皮素86.70 μg的混合对照品贮备液。精密吸取1 mL，逐级稀释，得一系列不同质量浓度的对照品溶液，备用。

2.3 分析条件 SinoChrome ODS-AP 柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相甲醇（A） -0.2% 醋酸水（B），梯度洗脱（0～20 min，30%～45% A；20～30 min，45% A；30～40 min，45%～50% A；40～60 min，50%～55%A）；体积流量0.5 mL／min；检测波长334 nm；柱温25 ℃；进样量10 μL。

ESI 源负离子检测；源电压3.5 Kv；鞘气（N2） 体积流量10.5 L／min；辅助气（N2） 体积流量1.5 L／min；碰撞气体为氦气；毛细管温度315 ℃；毛细管电压-30 V。采用全离子扫描方式，扫描范围m／z50～1 000。MS／MS 碰撞能量50%。

2.4 线性关系考察 精密吸取“2.2” 中的对照品贮备液1 mL，逐级稀释，制成系列不同质量浓度的6 份溶液。在“2.3” 项条件下进样，以峰面积为纵坐标（Y），对照品浓度为横坐标（X），进行回归。结果见表2。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.5 方法学考察

2.5.1 精密度试验 取同一供试品溶液，在“2.3” 项条件下连续进样6 次，每次10 μL，各对照品峰面积RSD 分别为1.69%、1.03%、1.82%、1.98%。表明仪器精密度良好。

2.5.2 重复性试验 取同一批次样品6 份，按“2.1” 项下方法平行制备6 份供试品溶液，在“2.3” 项条件下分别进样10 μL，各峰面积RSD分别为1.19%、1.30%、1.68%、1.33%。表明该方法重复性良好。

2.5.3 稳定性试验 取同一供试品溶液，在“2.3” 项条件下，分别于0、1、2、4、8、16、24 h各进样10 μL，峰面积RSD 分别为0.85%、0.81%、1.36%、1.60%。表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.5.4 加样回收率试验 取已知含有量的同一批药材，共6 份，分别加入质量浓度分别为4.27、20.02、20.00、43.35 μg／mL 的丁香酸、氧化白藜芦醇、芦丁、柚皮素混合对照品溶液0.4、0.5、0.6 mL，按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项条件下进样，计算含有量。结果见表3。

2.6 甲醇提取物HPLC-MS 分析 采用HPLC-MS对石斛甲醇提取物中化学成分进行定性分析见图1。根据各色谱峰的保留时间、紫外特征、分子离子峰及主要碎片峰信息结合相关文献、SciFinder和化学专业数据库等天然产物数据库收录的天然产物，可初步判断确认10 个化合物的结构。其中化合物6 首次从石斛属植物中得到。结果见表4。

表3 各成分加样回收率试验结果（n＝6）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

图1 各样品色谱图Fig.1 Chromatograms of various samples

表4 提取物HPLC-MS 检测结果Tab.4 Detection results of extracts by HPLC-MS

2.7 含有量测定

2.7.1 HPLC 色谱图 在“2.3” 项条件下进样，对照品及样品色谱图见图2。

图2 各成分HPLC 色谱图Fig.2 HPLC chromatograms of various constituents

2.7.2 样品含有量测定 按“2.1” 项下方法制备供试品溶液，在“2.3” 项条件下进样，测定各样品中各成分的含有量。结果见表5。

3 讨论

3.1 定性分析 共鉴定出10 个化合物，其中氧化白藜芦醇为首次在石斛属植物中得到。有研究表明氧化白藜芦醇具有抗炎、抗氧化、抗病毒、抗肿瘤［22］、神经保护［23］等作用。

表5 各成分含有量测定结果（μg／g）Tab.5 Results of content determination of various constituents （μg／g）

3.2 结果分析 霍山石斛和铁皮石斛能同时测定出4 种多酚类成分，且霍山石斛多酚类含有量高于铁皮石斛，霍山产铁皮石斛高于其他产地铁皮石斛。铜皮石斛中仅测定出丁香酸、氧化白藜芦醇和柚皮素；河南石斛中测定出丁香酸、芦丁和柚皮素；水草石斛中测定出丁香酸和柚皮素；紫皮石斛和金钗石斛中仅测定出丁香酸。不同品种石斛中多酚类成分含有量存在明显差异。与文献［24-26］报道不同石斛种属间、不同产地的铁皮石斛化学成分差异较大一致。课题组前期也发现霍山产铁皮石斛小分子化合物含有量高，具有一定特殊性［17］。

3.3 色谱条件 据文献［27-28］ 报道多酚类成分在240～280 和300～400 nm 2 个波长范围内有吸收峰，本实验考察了334、270 nm 2 个检测波长，发现在334 nm 处各成分的色谱峰峰形良好，吸收较大；比较了甲醇-0.2% 醋酸和乙腈-0.2% 醋酸2 种流动相体系，发现前者作为流动相时，各成分色谱峰峰形良好，分离度较高；考察了柱温25、30、35 ℃对分离效果的影响，发现25 ℃时，各成分的色谱峰峰形良好；考察了体积流量0.5、0.8、1.0 mL／min对分离效果的影响，表明0.5 mL／min时，各成分分离度较高。因此，本研究最终选择“2.3” 项下色谱条件。

本研究建立HPLC 法同时测定石斛中丁香酸、氧化白藜芦醇、芦丁和柚皮素的含有量，该方法准确，简便，重复性好，可用于石斛的质量控制。