不同年限苜蓿根际土壤细菌群落的多样性

刘震 徐玉鹏 赵忠祥 黄素芳 刘效朋 白艳梅 阎旭东

摘要：为研究不同年限苜蓿根际土壤细菌群落多样性及群落结构变化，选取了0、4年苜蓿的根际土壤，采用高通量基因测序技术研究其细菌构成。结果表明，4年苜蓿根际土壤中细菌分类单元（OTU）和多样性指数高于0年苜蓿，苜蓿连作会改变细菌群落数量及结构。通过主坐标分析（PCoA）及热图分析发现，不同年限苜蓿细菌群落差异性较大，连作后酸杆菌门、放线菌门、芽单胞菌门和绿弯菌门细菌群落丰度提高，变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门细菌群落相对丰度降低。

关键词：苜蓿;细菌群落;细菌分类单元;多样性指数;根际土壤;主坐标分析;热图分析;序列拼接;解释度;高通量基因测序技术

中图分类号： S154.38+1文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2020）08-0184-05

收稿日期：2019-03-19

基金項目：河北省现代农业产业技术体系草业创新团队栽培与信息化管理技术岗位项目（编号：HBCT2018160202）;河北省重点研发计划-奶业振兴重大技术创新专项（编号：19226437D）。

作者简介：刘 震（1985—），男，河北沧州人，硕士，助理研究员，主要从事作物栽培与施肥研究。Tel：（0317）2128657;E-mail：liuzhen84575151@163.com。

通信作者：阎旭东，硕士，研究员，主要从事作物栽培技术研究。Tel：（0317）2128657;E-mail：yxd7826@126.com。

苜蓿（Lotus corniculatus L.）为“牧草之王”，以产量高、品质好、营养丰富和适应性好而著称[1]，在河北地区被选为“首选牧草”而被大力推广[2]。同时，由于苜蓿的根瘤菌及其残留在地下的须根系形成腐殖质可以增加土壤有机质，改善土壤团聚体结构[3]，进一步影响土壤有机碳的分解，增强土壤碳吸附作用。因此，种植苜蓿常被作为改良贫瘠干旱地区土壤的方法之一。

目前，苜蓿栽培的研究方向主要集中于栽培措施对苜蓿产量及品质的影响[4-7]，关于苜蓿连作后对土壤环境影响的研究较少。杨敏等研究发现，连作魔芋可以增加土壤细菌数量，减少真菌及放线菌数量，同时影响土壤蛋白酶、过氧化氢酶和脲酶活性[8]。张玥等通过对不同年限茶园进行比较发现，连作后土壤pH值显著降低，土壤中优势菌种发生变化，茶园根际土壤肥力提高[9]，说明土壤作为一个复杂的环境，其中存在的微生物及土壤酶等均参与了土壤中养分形成、发育及循环[10]。细菌群落在植物-土壤生态系统循环中扮演着重要角色[11]。但苜蓿连作后对土壤细菌群落构成的影响如何，尚须进一步研究。

本研究利用沧州市农林科学院苜蓿长期试验，探讨连作不同年限苜蓿根际细菌群落结构及多样性差异，探索连作苜蓿对土壤细菌群落的影响，明确苜蓿对土壤生态环境的影响，为苜蓿改良土壤、牧草产业可持续发展提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 试验设计及样品采集

试验土壤选择0年苜蓿土壤作为对照（Y0，未种植过苜蓿的土壤，重复序号为M01、M02、M03）和4年苜蓿土壤（Y4，4年生苜蓿土壤，重复序号为M04、M05、M06）作为研究对象，田间按照正常管理措施进行。

采样地点位于沧州市农林科学院试验基地（116.36°E、38.31°N），选择“五点法”取样。各采样点内选取生长良好的苜蓿样品，去除其周边及表层杂草后，取耕层0～20 cm苜蓿根际土壤约50 g作为1个采样点，待5个采样点全部取完后充分混匀，采用四分法选取混合均匀后土壤样品保存为1份土壤待测样品，每个处理设3次重复。将待测样品装入无菌密封袋，放入装有干冰的泡沫箱中保存。待全部样品采集完成后运回实验室，超低温冰箱-80 ℃ 保存。

1.2 土壤样品DNA提取及测序

将土壤提取基因组后采用NanoDrop-ND1000测定总DNA浓度，并利用1%琼脂糖凝胶电泳检测总DNA提取质量。用引物338F（5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′）[12]和806R（5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′）[13]扩增细菌16S rDNA基因 V3～V4 区域，回收PCR产物并测定浓度，将不同重复间多个样品混匀。测序工作由北京百迈客生物科技有限公司完成。

1.3 序列拼接及信息分析

使用 FLASH v1.2.7软件，通过重叠（overlap）对每个样品的碱基序列进行拼接，得到的拼接序列即原始序列数据后，再使用 Trimmomatic v0.33软件，对拼接得到的原始序列进行过滤，得到高质量的重叠数据，最后使用 UCHIME v4.2软件，鉴定并去除嵌合体序列，得到最终有效序列（effective tags）。根据得出的有效序列进行信息分析。

1.4 细菌群落多样性及结构分析

采用Chao 指数、香农指数、ACE指数、辛普森指数及覆盖度表示细菌群落物种的丰富程度及测序深度。同时利用优化后的有效序列同细菌数据库进行比对，鉴定细菌种类，确定细菌归属，并进一步比较苜蓿土壤中不同水平下细菌群落构成状况。

2 结果与分析

2.1 连作苜蓿根际土壤细菌群落基因序列数据分析

样品经高通量测序后，经过双端碱基序列拼接、过滤后共产生 338 043 条有效序列。对照处理获得 54 534 条平均有效序列，连作苜蓿处理获得56 349条平均有效序列，其余序列数据见表1。

从样本中随机抽取一定数量的序列，统计这些序列所代表的物种数目，以序列数与物种数来构建曲线。由图1可知，各样本间稀释曲线平滑，表示测序数据结果合理，M01、M02、M03稀释曲线斜率及位置低于M04、M05、M06，说明对照处理能检测出的分类单元（OTU）数量少于连作苜蓿处理，可见连作苜蓿后可以增加根际土壤中细菌群落种类。

[5]麻冬梅，金风霞，蒙 静，等. 不同种植年限苜蓿对土壤理化性质、微生物群落和苜蓿品质的影响[J]. 水土保持研究，2013，20（5）：29-32.

[6]高燕丽，孙 彦. 利用近红外光谱分析预测紫花苜蓿干草品质[J]. 草地学报，2015，23（5）：1080-1085.

[7]毕舒贻，曹 婧，李 跃，等. 不同水肥组合对苜蓿品质的影响[J]. 草地学报，2018，26（1）：105-113.

[8]杨 敏，裴卫华，董家红，等. 魔芋连作对根际土壤微生物数量及酶活性的影响[J]. 北方园艺，2018，42（23）：110-115.

[9]张 玥，胡雲飞，王树茂，等. 茶园年限对根际土壤真菌群落结构及多样性的影响[J]. 应用与环境生物学报，2018，24（5）： 972-977.

[10]乔蓬蕾，吴凤芝，周新刚. 连作对作物根际土壤微生物菌群及酶活性影响[J]. 沈阳农业大学学报，2013，44（5）：524-530.

[11]殷继忠，李 亮，接伟光，等. 连作对大豆根际土壤细菌菌群结构的影响[J]. 生物技术通报，2018，34（1）：230-238.

[12]Walter J，Tannock G W，Tilsala-Timisjarvi A，et al. Detection and identification of gastrointestinal Lactobacillus species by using denaturing gradient gel electrophoresis and species-specific PCR primers[J]. Applied and Environmental Microbiology，2000，66（1）： 297-303.

[13]McBain A J，Bartolo R G，Catrenich C E，et al. Microbial characterization of biofilms in domestic drains and the establishment of stable biofilm microcosms[J]. Applied and Environmental Microbiology，2003，69（1）： 177-185.

[14]Wang Y，Sheng H F，He Y，et al. Comparison of the levels of bacterial diversity in freshwater，intertidal wetland，and marine sediments by using millions of illumina tags[J]. Applied and Environmental Microbiology，2012，78（23）： 8264-8271.

[15]Grice E A，Kong H H，Conlan S，et al. Topographical and temporal diversity of the human skin microbiome[J]. Science，2009，324（5931）： 1190-1192.

[16]賈倩民，陈彦云，刘秉儒，等. 干旱区盐碱地不同栽培草地土壤理化性质及微生物数量[J]. 草业科学，2014，31（7）：1218-1225.

[17]董立国，蒋 齐，蔡进军，等. 基于Biolog-ECO技术不同退耕年限苜蓿地土壤微生物功能多样性分析[J]. 干旱区研究，2011，28（4）：630-637.

[18]徐丽君，王 波，玉 柱，等. 不同生长年限敖汉苜蓿草地土壤呼吸研究[J]. 干旱区研究，2009，26（1）：14-20.

[19]张红娟，陈 丽，赵 芳，等. 山西临汾小麦—玉米轮作田土壤微生物多样性分析[J]. 中国植保导刊，2018，38（11）：9-15.

[20]张 翔，宋水山，黄亚丽，等. 基于高通量测序分析河北省中南部地区耕地土壤细菌多样性[J]. 华北农学报，2018，33（4）：196-203.