穴位电刺激对脑缺血后大鼠臂丛神经细胞凋亡的影响*

林菊珊 蔡 楠 杨代和△ 张世欣 吴雅婷 谢步霓 潘晓鸣 廖远生

肢体疼痛是脑缺血后常见并发症，发生率高达30%以上[1]，严重影响患者生活质量。肢体疼痛的产生与神经损伤密切相关[2]。前期研究证明，穴位电刺激可抑制大鼠脊髓背角及脊神经后根细胞凋亡，缓解疼痛症状[3]。臂丛神经是上肢疼痛传导通路，目前穴位电刺激是否影响臂丛神经细胞凋亡尚未知，本研究通过脑缺血再灌注大鼠(MACO)模型，观察穴位电刺激曲池、足三里对大鼠臂丛组织中Caspase-3、Bax和Bcl-2表达及神经细胞凋亡的影响。

1 材料与方法

1.1 一般资料 120只雄性SD大鼠(400～450 g)随机分为3组，每组40只，假手术组(S组)、缺血再灌注组(I/R组)和电刺激组(EA组)。3组都用10%水合氯醛0.5 ml腹腔注射麻醉，消毒大鼠颈部皮肤，从颈部正中线作纵行切口(约2 cm)，钝性剥离，暴露左侧颈总动脉、颈外动脉和颈内动脉。S组，逐层缝合皮下筋膜及皮肤，未进行其他处理； I/R和EA组造脑缺血再灌注模型，在颈总动脉近分叉位置剪开“V”形小口，将3-0单股尼龙线从小口插入(提前在尼龙线上做好刻度标记，头端磨钝，并用10%L-赖氨酸浸泡)，经颈总动脉分叉处插入颈内动脉，以颈动脉分叉为起始，插入深度为(1.5±0.5) cm，缝合切口，栓塞1 h后取出尼龙线，苏醒后提尾，以右前肢屈曲或爬行向右侧划圈为脑缺血再灌注造模成功标志，I/R组未进行其他处理，EA组给予“曲池”“足三里”穴位电刺激治疗。分别于实验前(T0)及实验第1天(T1)、3天(T2)、7天(T3)、14天(T4)，通过电子测痛仪观察并记录大鼠疼痛阈值。于T1、T2、T3和T4各取10只大鼠处死，取出右侧臂丛神经，采用Western blot检测大鼠臂丛神经中Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白的表达。

1.2 方法

1.2.1 穴位电刺激方法 自然光照，室温控制(22±3) ℃。每天9:00—9:30和15：00—15:30将3组大鼠放置于自制固定装置，暴露四肢及尾部。马冉冉等[4]研究认为通过电针刺激患侧”曲池”“足三里”，可抑制脑缺血再灌注损伤后炎症级联反应，本研究中EA组选取上述穴位,将华佗牌28号1寸毫针(苏州医疗用品有限公司)插入患侧“曲池”“足三里”，入皮5 mm，毫针接LH-800型韩式穴位神经刺激仪(北京航空航天大学制造)，用疏密波(频率2～15 Hz，强度1 mA)进行穴位电刺激。从造模成功后第1天开始，每天上午、下午各1次，每次30 min。S组及I/R组则不进行穴位电刺激。

1.2.2 观察指标 ①疼痛阈值检测。用Von Frey电子测痛仪(IITC Life Science公司，美国)检测各组大鼠造模前、造模后T1、T2、T3和T4时患侧足底机械缩足反射阈值(mechanical withdrawal threshold, MWT)[5]的变化，记录各组大鼠疼痛阈值。②Western blot检测Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达。取标本放入组织裂解液中匀浆，离心后取上清，即为组织块用冷TBS洗涤3次，去除血污，剪成小块置于匀浆器上。加入10倍组织体积本试剂(使用前数分钟配制，cocktail+磷酸化蛋白酶抑制剂)，彻底匀浆；将匀浆液转移至1.5 ml离心管中振荡，冰浴30 min；以12000转离心5 min，收集上清为总蛋白溶液；灌胶，上样加足够电泳液后电泳，待电泳至溴酚蓝刚出时终止电泳，进行转膜；在脱色摇床上将转好的膜用5%的脱脂牛奶(0.5%TBST配)封闭1 h。稀释一抗(TBST溶解的5%脱脂牛奶)，4 ℃过夜。在TBST脱色摇床上洗3次，每次5 min。用TBST稀释二抗3000倍，室温下孵育30 min，在室温下在TBST脱色摇床上洗3次，每次5 min。将膜蛋白面朝上与混合液充分接触，1～2 min后，去尽残液，包好后放入X光片夹中曝光。将胶片扫描，用Alpha软件分析目标带的光密度值，用相对灰度值代表蛋白表达情况(相对灰度值=待测蛋白灰度值/β-actin灰度值)。

1.2.3 统计学方法 所有数据用SPSS 17.0进行统计分析，组内比较采用配对样本t检验，组间比较采用成组样本t检验。

2 结果

2.1 一般行为学观察 3组大鼠一般情况良好，体质量稳定上升，3组比较无显著差异性表现。I/R组和EA组大鼠均出现提尾右前肢屈曲或爬行向右侧划圈，但EA组大鼠患侧前肢屈曲及爬行向右划圈等症状得到一定改善。I/R组大鼠死亡2只，EA组大鼠死亡1只，实验过程中对应补齐数据。

2.2 疼痛阈值结果 3组大鼠实验前MWT无明显差异性(P>0.05)；S组MWT实验前后无明显差异(P>0.05)；与组内T0比较，T1、T2、T3和T4时I/R组和EA组MWT更低(P<0.01)；与S组比较，T1、T2、T3和T4时I/R组和EA组MWT更低(P<0.01)；与I/R组比较，T3和T4时EA组MWT更高(P<0.05或0.01)。见图1。

图1 各组大鼠MWT比较

2.3 Western blot检测臂丛神经细胞Caspase-3、Bax和Bcl-2蛋白表达结果

2.3.1 臂丛神经细胞Caspase-3蛋白表达结果 S组大鼠臂丛神经细胞Caspase-3蛋白表达实验前后无差异(P>0.05)；与组内T1比较，T2、T3和T4时I/R组和EA组Caspase-3蛋白表达增强(P<0.01)；与S组比较，T1、T2、T3和T4时I/R组和EA组Caspase-3蛋白表达更高(P<0.01)；与I/R组比较，T3和T4时EA组Caspase-3蛋白表达更低(P<0.01)。见图2。

2.3.2 臂丛神经细胞Bax蛋白表达结果 S组大鼠臂丛神经细胞Bax蛋白表达实验前后无差异(P>0.05)；与组内T1比较，T2、T3和T4时I/R组和EA组Bax蛋白表达增强(P<0.05或0.01)；与S组比较，T1、T2、T3和T4时I/R组和EA组Bax蛋白表达更高(P<0.01)；与I/R组比较，T3和T4时EA组Bax蛋白表达更低(P<0.01)。见图3。

图2 各组大鼠Caspase-3比较

图3 各组大鼠Bax比较

2.3.3 臂丛神经细胞Bcl-2蛋白表达结果 S组大鼠臂丛神经细胞Bcl-2蛋白表达实验前后无差异(P>0.05)；与组内T1比较，T2、T3和T4时I/R组和EA组Bcl-2蛋白表达降低(P<0.05或0.01)；与S组比较，T1、T2、T3和T4时I/R组和EA组Bcl-2蛋白表达降低(P<0.01)；与I/R组比较，T3和T4时EA组Bcl-2蛋白表达更高(P<0.01)。见图4。

图4 各组大鼠Bcl-2比较

3 讨论

大鼠臂丛神经由C5～8和T1前支组成，包括传入和传出神经纤维，支配前肢的感觉和运动功能。脑缺血后引起对侧肢体瘫痪和功能障碍，本研究采用左侧颈内动脉插入尼龙线，制作脑缺血/再灌注大鼠模型，表现右前肢偏瘫，在运动中偏瘫肢体自我保护能力差，并且容易受伤，导致偏瘫侧肢体臂丛神经损伤。脑缺血/再灌注损伤，导致交感神经和传入神经偶联会产生恶性循环，增强患侧肢体交感神经的兴奋性，造成局部组织发生营养障碍，引发患侧肢体疼痛[6]。袁群芳等[7]研究认为，臂丛神经损伤，可以导致脊髓前角运动神经元细胞的损伤及死亡，并对前后角的功能起到了损伤作用，发生神经性疼痛。本研究发现，穴位电刺激组比脑缺血/灌注组疼痛阈值高，与前期研究相符，穴位电刺激能降低脑缺血/灌注损伤大鼠的脊髓背角神经细胞凋亡，稳定脊髓背角神经细胞功能的作用，调节疼痛信息的传递，减缓神经病理性疼痛发作[3]；也可能与穴位电刺激可以下调中脑导水管周围灰质、中缝背核、中缝大核中孤啡肽受体mRNA的表达，提高体内脑啡肽和内啡肽效力，起到镇痛效果有关[8]。

中医学认为，疼痛的病机在于各种原因造成的气血运行障碍，“不通则痛”；气血虚少，“不荣则痛”。针刺是中医的特色疗法，电刺激穴位能有效缓解急慢性疼痛，疗效得到国内外认可。“曲池”“足三里”穴是治疗肢体疼痛的常用穴位，电刺激穴位邻近神经以及周围血管，改善局部血液循环，减少炎症和渗出，缓解疼痛症状[9]。

Bax和Bcl-2基因在细胞凋亡调控过程中是一对重要的调控基因，它们功能相互对立，Bax促进细胞凋亡，而Bcl-2则可通过多种途径抑制细胞凋亡，而Caspase-3在细胞凋亡过程中则是关键的凋亡执行蛋白酶。有文献报道，电针对脑缺血后内源性神经干细胞的增值、分化和修复方面有一定的调节作用，针刺治疗可下调Bax的表达，上调Bcl-2水平，提高Bcl-2/Bax的比值，抑制Caspase-3的活性，抑制神经细胞凋亡[10，11]。Wang Y等[12]研究认为神经损伤可促使小胶质细胞活化和促炎细胞因子IL-1β释放，诱发神经源性疼痛超敏反应，产生持续性神经病理性疼痛，2 Hz穴位电刺激能增加脊髓神经传导通路上α-7烟碱乙酰胆碱释放，抑制脊髓小胶质细胞活化和促炎细胞因子IL-1β释放，从而改善大鼠脑缺血再灌注损伤，促进神经细胞修复，起到镇痛效果。本研究2-15 Hz穴位电刺激组比脑缺血/再灌注组臂丛神经细胞中Caspase-3和Bax表达更少，Bcl-2表达更多，凋亡细胞更少，表明穴位电刺激可以减少脑缺血/再灌注损伤大鼠臂丛神经细胞凋亡，并且可能通过臂丛神经α-7烟碱乙酰胆碱释放，抑制臂丛神经小胶质细胞活化和促炎细胞因子IL-1β释放，从而促进脑缺血/再灌注损伤大鼠臂丛神经修复，以及瘫痪肢体康复。

总之，对脑缺血/再灌注损伤大鼠“曲池”和“足三里”穴位进行电刺激，可以提高疼痛阈值，缓解疼痛，减少臂丛神经凋亡，促进臂丛神经修复，可能与调节凋亡相关蛋白Casepase-3、Bax和Bcl-2的表达有关，但其中详细的细胞分子机制还有待进一步深入研究。