免疫组化双重标记联合特殊染色技术应用于胶质瘤血管新生的分析

匡晓燕，张 艺，申腾飞，蒋雪峰

胶质瘤是好发于成人的原发性中枢神经系统肿瘤，约占恶性脑肿瘤的81%[1]。血管新生化是胶质瘤，尤其是胶质母细胞瘤(glioblastoma, GBM)的突出组织病理学特征，且与其侵袭性和临床不良预后密切相关[2]。因此，探寻胶质瘤中特殊的促血管新生因子，对于研发阻断肿瘤源性血管发生的精准治疗策略，改善这类血管化肿瘤的临床疗效，显得尤为重要。本实验联合应用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)双重标记和过碘酸雪夫(periodic acid-Schiff, PAS)特殊染色技术，发现胶质瘤细胞内生性的一种生长因子——神经胶质成熟因子-β(glia maturation factor-β, GMF-β)的表达与肿瘤血管新生的相关性。

1 材料与方法

1.1 样本收集2006年1月～2009年12月陆军军医大学(原第三军医大学)西南医院病理科存档的50例人GBM标本，病理诊断皆根据WHO(2016)中枢神经系统肿瘤分类标准再次明确。

1.2 免疫组化标本均经10%中性福尔马林固定，石蜡包埋后切片备用。(1)单标染色：参照EnVision试剂盒(丹麦Dako公司，K5007)两步法操作，一抗4 ℃孵育过夜，二抗37 ℃孵育30 min，之后DAB显色呈棕黄色。(2)双标染色：应用DouSP双标试剂盒(KIT-9999，福州迈新公司)，操作步骤严格按试剂盒说明书进行。第一轮标记用5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸盐/氯化硝基四氮唑蓝(BCIP/NBT)显色呈蓝黑色，第二轮标记用3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)显色呈鲜红色。如果双重标记后PAS呈紫红染色，则用DAB棕黄显色替代AEC的红色。单标和双标染色均设置同型对照和磷酸盐缓冲液空白对照。

所用一抗包括：兔抗人GMF-β多克隆抗体(NBP1-89755；稀释比1 ∶200，美国Novus公司)、兔抗人GFAP多克隆抗体(NB300-141；稀释比1 ∶1 000，美国Novus公司)，同型对照为兔IgG。鼠抗人CD31单克隆抗体(NB600-562；稀释比1 ∶10，美国Novus公司)，同型对照为鼠IgG1κ。GMF-β表达水平通过半定量IHC-score评分法[3]评估。微血管的判定和计数参照Weidner标准[4]，低倍镜下筛选3个血管最丰富的肿瘤区域，高倍镜下(400×)观察，凡是孤立存在的CD31阳性微血管，包括CD31阳性的单个或成团细胞，皆纳入微血管计算，取3个视野的平均值即为该样本的微血管密度(microvessel density, MVD)值。胶质瘤细胞稳定表达而血管内皮不表达的神经胶质分化标志物GFAP，作为瘤细胞表达的阳性对照、血管内皮表达的阴性对照。

1.3 PAS特殊染色采用PAS染色试剂盒(MST-8038，福州迈新公司)，过碘酸染色10 min，水洗之后，Schiff氏液染色10～20 min，倾去染色液，直接滴加偏重亚硫酸钠作用1 min(2次)。

1.4 统计学分析所有数据采用GraphPad Prism 6.02软件进行统计学分析，选用线性回归模型分析胶质瘤组织中GMF-β表达与MVD的关系，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肿瘤细胞和血管内皮中GMF-β的表达(1)IHC单标：GMF-β的表达定位于细胞质。单标染色检测发现，不仅肿瘤细胞中存在GMF-β的表达，在血管腔面也有GMF-β阳性着色(图1A)。(2)IHC双标：为进一步验证GMF-β亦表达于血管内皮，实验采用双标染色技术。对照组GFAP/CD31中，GFAP仅表达于肿瘤细胞，不表达于CD31阳性的血管内皮中(图1B)。而实验组GMF-β/CD31双标染色结果明确显示，CD31阳性血管内皮中也存在GMF-β的表达，尤其是在具有肿瘤微血管构筑表型异质性(tumor microvascular architecture phenotype heterogeneity, T-MAPH)的血管丛中，GMF-β强阳性更多见(图1C、D)。另外，还观察到某些共表达GMF-β和CD31的散布间变瘤细胞簇(图1E)。(3)IHC双标+特殊染色：GMF-β/CD31双标套染PAS的结果显示，除了CD31标记血管壁上有PAS阳性基膜成分，在某些GMF-β阳性瘤细胞构成的血管腔样结构外围，亦检测到PAS阳性基膜样物质沉积(图1F)。

2.2 肿瘤细胞和血管内皮中GMF-β表达与MVD的关系50例GBM中，肿瘤细胞GMF-β表达的IHC评分与MVD之间存在显著正相关(r=0.458 8，P<0.001，图2A)，而血管内皮GMF-β表达的IHC评分与MVD亦呈正相关，且相关性更显著(r=0.667 6，P<0.000 1，图2B)。

3 讨论

组织形态学特征与分子检测相结合的“整合诊断”(integrated diagnosis)，在肿瘤病理学研究中具有重要意义[5]。与其它分子生物学技术相比，IHC技术具有在组织原位将功能蛋白表达与组织形态学变化有机结合的优势，且便于大样本分析。与传统IHC单标相比，双重标记可在同一张组织切片上同时显示两种蛋白表达的相关性，已应用于肿瘤侵袭检测、复发风险、预后评估等多方面的研究领域[6-7]。

ABCDEF

图1A.GMF-β单标：瘤细胞阳性，血管腔面阳性着色(箭头)；B.对照组双标：瘤细胞GFAP阳性(红箭头)，CD31阳性血管(黑箭头)； GMF-β/CD31双标：肾小球样(C)、树枝样(D)血管丛中GMF-β的表达，瘤细胞共表达GMF-β和CD31(E)，红、黑箭头分别示GMF-β、CD31阳性；F.GMF-β/CD31/PAS三重染色，黄、黑、红箭头分别示GMF-β、CD31、PAS阳性

图2 胶质母细胞瘤中GMF-β表达水平与MVD的相关性：肿瘤细胞(A)、血管内皮(B)中GMF-β表达评分与MVD之间呈正相关

“BCIP/NBT+AEC”双标显色体系，应用于肿瘤血管新生的组织学研究，具有独特的优点：(1)先用碱性磷酸酶显色剂BCIP/NBT呈现的蓝黑色突出显示血管轮廓，后用辣根过氧化物酶显色剂AEC使得血管新生相关因子呈鲜红色。(2)两种着色反差大、对比鲜明，利于直观、便捷地观察候选因子的表达定位和表达强弱与肿瘤血管之间的关系。当然，这套显色体系也有一定的应用局限性。其中，过氧化物酶与底物AEC反应形成的红色沉淀，可溶于有机溶剂，而且褪色较快，因此需用水性封片剂封片，并及时观察、摄像。另外，对于细胞核表达的相关因子，需应用BCIP/NBT显色时，后续应注意把控苏木精轻度复染，以免BCIP/NBT与苏木精的着色效果混淆。

近年来，其它研究组对IHC也做出了相应的改进[8-9]。针对“BCIP/NBT+AEC”显色体系的局限性，以及套染PAS的技术需求，作者采取的改进措施是，将第二轮标记时与过氧化物酶反应的底物AEC替换为DAB。如此，第二标志物呈现DAB的棕黄显色，与后续PAS紫红染色之间的对比度增大。“BCIP/NBT+DAB+PAS”三重染色的切片经二甲苯透明和中性树胶封固，可长期保存切片染色结果。

本实验设计优化的组织化学三重染色技术，应用于胶质瘤血管新生的研究。已知GMF-β的主要生理功能是促进神经胶质分化，基于神经分化和血管生长之间交互调控、协同促进的机制[10]，我们探讨GMF-β是否具有促进胶质瘤源性血管发生的潜在作用。本实验结果显示，GMF-β在肿瘤细胞和血管内皮中均表达，且皆与MVD呈正相关；GMF-β优势表达于具有构筑表型异质性的肿瘤血管上；某些GMF-β阳性瘤细胞表达内皮特异标志物CD31，或者构成血管腔样结构(PAS阳性)。上述发现初步提示，GMF-β参与促进胶质瘤血管新生，并可能介导GBM细胞形成血管拟态(vascular mimicry, VM)样结构或发生内皮样分化，为胶质瘤细胞参与构成新生血管的理论[11]提供新的实验依据。本组的后续体内外实验也进一步验证了GMF-β促进胶质瘤源性血管形成的作用[12]，该因子有望作为胶质瘤的独立预后指标以及抗血管治疗靶点。总之，发挥IHC双重标记和特殊染色的技术优势，有利于发现新的促肿瘤血管生成因子，对于胶质瘤和其它血管化肿瘤的研究，具有特别的应用意义。