血管肉瘤相关miRNAs的生物信息学预测及分析

魏院锋，张海俊，李 丽，张 璐，金 珊，邹 泓，贾 薇，庞丽娟

血管肉瘤是一种高度恶性的内皮细胞肿瘤，发病率较低，约占软组织肉瘤的2%[1]。本病恶性程度高，病情进展快，早期易发生转移，5年生存率极低[2]。目前主要治疗手段是手术切除，但局部复发率高，治疗效果差。因此急需寻找有效的标志物用于血管肉瘤的早期诊断和治疗。microRNAs(miRNAs)是一类高度保守的长度为19～22个碱基的非编码小RNAs，几乎在所有疾病的病理生理过程中发挥着重要的作用。目前关于血管肉瘤的具体发病机制、特异肿瘤标志物的筛选及其治疗靶点的研究较少，阻碍了血管肉瘤的诊疗。本实验从基因表达数据库(gene expression omnibus, GEO)中下载血管肉瘤及良性毛细血管瘤的miRNAs芯片数据，筛选出两者之间差异明显的miRNAs并进行相关生物信息学分析，为阐明miRNAs在血管肉瘤的恶性生物学行为中发挥的功能及其具体分子机制研究奠定基础，为血管肉瘤的早期诊断、靶点研究等提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料从GEO数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)中下载血管肉瘤表达谱芯片的矩阵数据(GSE65657)，该数据包含了3例血管肉瘤患者(GSM1602577-2579，2例女性，1例男性，年龄分别为65、47、48岁)，3例毛细血管瘤患者(GSM1602580-2582，2例女性，1例男性，年龄分别为38、39、40岁)。

1.2 差异miRNAs的筛选血管肉瘤和毛细血管瘤之间的差异miRNAs筛选使用GEO在线分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)进行，筛选的条件是：P<0.05和|log fold-change|≥4，筛选出的差异表达miRNAs用R包进行聚类热图及火山图绘制。

1.3 差异miRNAs的靶基因预测差异表达的miRNAs靶基因预测使用miRWalk 2.0(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)网站进行，该网站包含miRWalk、miRanda、RNA22及Targetscan等多个miRNAs靶基因预测工具。为提高预测靶基因的准确性及降低假阳性率，选择在列举的这四个数据库中均能预测到的基因被认为是靶基因。

1.4 差异miRNAs靶基因的基因本体(gene ontology, GO)功能富集分析细胞组分(cellular component)、分子功能(molecular function)、生物过程(biological process)是GO的三个主要方面。把目标靶基因列表提交到FunRich 3.1.3软件(http://www.funrich.org/)中进行GO功能富集分析。

1.5 差异miRNAs靶基因的KEGG通路富集分析京都基因与基因组百科全书(kyoto encyclopedia of genes and genomes, KEGG)是一个基因功能系统分析的数据库，根据高通量分子水平信息注解生物系统的高级功能。把靶基因导入KEGG在线分析工具KOBAS 3.0(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)中进行靶基因信号通路富集的分析，显著富集通路的筛选标准为P<0.05和矫正后P<0.05。

1.6 差异miRNAs靶基因的蛋白相互作用分析将主要参与GO及KEGG富集分析中的靶基因导入String11.0在线分析网站(https: //string-db.org/)，参数设置为最低互作分值设置成高度可信(highest confidence: 0.9)、隐藏网络中断开的节点及不相关的节点。

2 结果

2.1 差异miRNAs筛选的结果按照P<0.05和|log fold-change|≥4的条件进行差异miRNAs的筛选，筛选出53个差异表达miRNAs，其中上调者51个，下调者2个(图1)。下调的miRNAs及部分显著上调的差异miRNAs见表1。

表1 部分差异表达的miRNAs

图1 A.差异表达miRNAs的聚类图；B.差异表达miRNAs的火山图；红色代表上调的miRNAs，绿色代表下调的miRNAs，黑色代表miRNAs变化不显著，色键从绿色至红色变化提示miRNAs表达增强

2.2 差异miRNAs靶基因预测结果为了阐明血管肉瘤中差异miRNAs的功能，使用常用的miRNAs靶基因预测网站对53个差异miRNAs进行靶基因预测，选取在4个数据库中均能预测到的基因为靶基因，最终有6 853个基因认定为靶基因。

2.3 GO功能富集分析GO富集分析分为三大类：细胞组分、分子功能、生物过程，将6 853个靶基因输入Funrich软件进行GO功能富集分析。结果发现差异miRNAs的靶基因在生物过程方面显著富集于细胞通讯、信号转导等；细胞组分方面主要集中于内体、细胞质、细胞质膜等；分子功能方面主要涉及转运活性、细胞黏附分子活性等(图2)。

2.4 KEGG通路富集分析通路富集分析发现，差异表达miRNAs的靶基因显著富集于肿瘤信号通路、代谢通路、环腺苷酸(cAMP)信号通路、丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)信号通路、PI3K/AKT信号通路、Ras信号通路等210条通路，富集最显著的10条通路见图3。

图2 差异miRNAs靶基因GO功能富集分析：A.生物过程；B.细胞组分；C.分子功能

图3 差异表达miRNAs靶基因KEGG信号通路富集分析

2.5 miRNAs重要差异靶基因的蛋白互作网络选取显著性GO和显著性KEGG信号通路及其所属的靶基因的交集在String11.0(https://string-db.org/)在线分析网站构建蛋白互作网络，去除不相关的节点，结果发现在差异miRNAs靶基因编码蛋白互作网络中，STAT3、TP53、MAPK1、SRC、PIK3R1、RAP1B、S1PR3等在网络中具有重要地位(图4)。

3 讨论

血管肉瘤是一种高度恶性的软组织肉瘤，预后极差。目前关于人血管肉瘤的研究大多为个案报道[3]，关于其具体的发病机制及相关治疗靶点的研究较少，严重阻碍血管肉瘤的诊疗进展。本实验从GEO数据库中下载血管肉瘤及良性毛细血管瘤miRNAs表达谱芯片数据，利用GEO在线分析工具GEO2R(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/geo2r/)将样本设为血管肉瘤组及良性毛细血管瘤组，按照P<0.05和|log fold-change|≥4的条件进行筛选，筛选出53个差异表达的miRNAs，接下来运用miRNAs靶基因预测网站miRWalk 2.0(http://zmf.umm.uni-heidelberg.de/apps/zmf/mirwalk2/)对差异表达的53个miRNAs进行靶基因预测，该网站包含miRWalk、miRanda、RNA22及Targetscan等多个miRNAs靶基因预测工具。为了提高预测靶基因的准确性及降低假阳性率，选择在列举的这四个数据库中均能预测到的基因被认为是靶基因，并对靶基因进行GO及KEGG富集分析，结果发现靶基因参与多个与肿瘤恶性生物学行为密切相关的生物过程、代谢途径和信号通路。

图4 蛋白互作网络图：圆圈表示靶基因对应的蛋白质，连线表示蛋白质之间相互作用，蛋白质之间的连线越多表示蛋白质越重要

筛选的53个差异表达的miRNAs中，按P值排序下调最显著的是hsa-miR-518b，上调最显著的是hsa-miR-137。有研究发现miR-137可通过靶向肝癌细胞中的EZH2-STAT3信号传导途径抑制肝癌的迁移和侵袭能力，miR-137-EZH2-STAT3可能是治疗人肝细胞癌的潜在治疗靶标[4]。Fasihi等[5]研究提示hsa-miR-137可调节Wnt信号通路，从而影响结直肠癌的生物学行为。Lv等[6]的研究结果表明miR-137可以通过下调GLO1的表达从而抑制黑素瘤细胞增殖。Li等[7]发现miR-137通过调节XIAP促进卵巢癌细胞的凋亡。Hu等[8]表明hsa-miR-518b的表达与膀胱癌的预后相关。Yanokura等[9]的研究结果提示hsa-miR-518b可作为子宫内膜癌的预后生物标志物。然而关于hsa-miR-518b和hsa-miR-137在血管肉瘤发生、发展过程中的功能，目前尚未见报道，仍需进一步探讨。

将差异表达miRNAs的靶基因进行GO及KEGG信号通路富集分析，结果发现这些靶基因主要参与细胞通讯、信号转导等生物学过程，主要参与cAMP信号通路、MAPK信号通路、PI3K/AKT信号通路、Ras等信号通路。有研究发现PI3K/AKT/mTOR、MAPK、Ras信号通路在肿瘤中处于异常激活状态，并对肿瘤的侵袭、迁移等恶性生物学行为起重要的调节作用。Chen等[10]研究发现miR-27b可以靶向PI3K p110α，以抑制结直肠癌干细胞的增殖和迁移。Liu等[11]研究发现miR-21-5p可通过靶向PDCD4调节PI3K/AKT/FOXO1信号传导通路来抑制舌鳞状细胞癌的凋亡。Wang等[12]表明SOX9/miR-203a可以激活PI3K/AKT信号通路，从而促进食管癌的进展。在血管肉瘤组织中PI3K/AKT/mTOR通路同样处于异常活化状态，其可能成为血管肉瘤的治疗靶点。Wada等[13]研究表明PI3K/mTOR抑制剂NVP-BEZ235可抑制血管肉瘤细胞的生长。Adachi等[14]亦发现PI3K/AKT/mTOR相关蛋白在犬血管肉瘤中高表达，以上研究结果提示PI3K/AKT/mTOR信号通路可能是血管肉瘤治疗的重要靶点。Wang等[15]发现miR-1204可通过靶向ZNF418从而激活MAPK和C-Jun/AP1信号通路来促进肝癌的进展。Wang等[16]提示miR-134可通过激活PLXNA1介导的MAPK信号传导通路阻止食管鳞状细胞癌的发展。在血管肉瘤中，Arbiser等[17]发现磷酸化的MAPK在血管肉瘤中低表达，而在良性毛细血管瘤及化脓性肉芽肿中高表达，提示磷酸化MAPK可能与血管肉瘤的恶性程度呈负相关。同样，Ras信号通路与多种肿瘤的恶性生物学行为也密切相关。Soleimani等[18]研究发现RAS/MAPK信号通路调控的miRNAs在结直肠癌的病程进展中发挥重要作用。Boivin-Angele等[19]在肝血管肉瘤中发现了Ras突变。以上结果提示PI3K/AKT、MAPK、Ras等信号通路可能存在交互作用共同促进了血管肉瘤的发生、发展，但其具体的机制仍待进一步研究。

应用String进一步对主要的靶基因构建蛋白互作网络，结果发现差异miRNAs主要调控STAT3、TP53、MAPK1等关键靶蛋白的表达。Yang等[20]研究发现靶向NF-κB/IL-6/STAT3途径可能为血管肉瘤的靶向治疗提供理论依据。Petterino等[21]发现STAT3在犬血管肉瘤中处于高度活化状态。Calvete等[22]报道TP53的状态与血管肉瘤密切相关。Verbeke等[23]发现TP53在骨血管肉瘤中低表达。String网站预测的有重要作用的靶蛋白与上述研究中报道的蛋白较一致，提示这些靶蛋白可能是血管肉瘤恶性生物学进展中的关键蛋白。

综上所述，本组实验发现miRNAs的异常表达在血管肉瘤的恶性生物学行为中发挥着关键作用，差异表达miRNAs的主要靶基因参与许多与肿瘤恶性生物学行为相关的生物过程和信号通路，为后续进一步研究血管肉瘤发生、发展提供重要的研究依据。