肺腺癌组织中CPNE1蛋白的表达及临床意义

宋鹏涛，刘顺林，刘志聪，平金良

肺癌是全球范围内常见的恶性肿瘤，因缺乏有效的诊断标志物造成其早期诊断率低，一旦发现多数已处于晚期，导致其治疗效果差，预后不良，病死率极高，5年生存率仅为15%左右。因此，寻找敏感、高效和特异性强的早期诊断标志物成为迫在眉睫的任务，这在肺癌的防治中起着至关重要的作用。

Copines蛋白家族是新近发现的一类分布广泛、进化保守的Ca2+依赖性磷脂结合蛋白[1]。最近研究表明，CPNE家族成员与肿瘤的发生、发展有关[2]。Copine1(CPNE1)是Copines家族中第一个被发现的成员，其定位于人第20号染色体上，编码537个氨基酸[3]。但目前对该基因的研究报道非常少，而在肿瘤方面的研究更鲜有报道。本课题组前期实验发现，CPNE1蛋白在肺腺癌组织中的表达强度明显高于正常肺组织，本实验应用免疫组化SP法和RT-PCR技术检测CPNE1在肺腺癌组织和正常肺组织中的表达及其与肺癌临床病理特征的关系，为肺癌的早期诊断和临床预后评估奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料收集2007～2012年浙江省湖州市中心医院病理科诊断的人肺腺癌标本186例，所有肺腺癌患者术前均未行放、化疗等其他治疗。其中男性96例，女性90例，年龄20～79岁，平均59岁；正常肺组织30例，其中男性20例，女性10例，年龄45～73岁，平均60岁，所有组织标本均经两位病理科医师证实。所有标本均按照2009年国际抗癌联盟(AJCC)TNM分期标准进行临床分期，其中Ⅰ+Ⅱ期101例，Ⅲ+Ⅳ期85例；分化程度：低分化94例，高+中分化92例。

1.2 方法

1.2.1免疫组化 采用免疫组化SP法检测CPNE1的表达。石蜡包埋组织4 μm厚切片，常规脱蜡，梯度乙醇(95%、85%、75%)水化，抗原修复液(0.01 mol/L枸橼酸钠缓冲液，pH 6.0)修复2次，PBS洗涤3次，一抗4 ℃过夜(1 ∶2 000兔抗人CPNE1)，其中阴性对照所用的一抗则用正常的羊血清，过夜后PBS洗涤，加入二抗，37 ℃，孵育时间30 min，DAB显色，苏木精复染，中性树胶封固等步骤后进行观察[4]，操作步骤严格按检测试剂盒说明书进行。

结果判定与分析：CPNE1蛋白在肺腺癌组织及正常肺组织中免疫组化结果判断标准参考Yu等[5]的方法，光镜下观察整个组织标本的着色范围与着色强度。CPNE1蛋白阳性定位于细胞质及细胞膜，呈棕黄色或棕褐色颗粒。在高倍镜下(×400)，以5个不同的视野为随机采取对象，计算阳性细胞总数，按阳性细胞数所占的百分比(P)计算分值：阳性细胞数<10%为1分，10%～50%为2分，50%～75%为3分，>75%为4分；按照细胞染色强度计分：阴性为1分，弱阳性为2分，中等强度为3分，强阳性为4分。将两项得分结果相乘：4分以下为(-)；4～8分为(+)；8～12分为()；12～16分为()。(～)级为高表达，属于高表达组，(-～+)为低表达，属于低表达组。同时根据肺腺癌患者性别、年龄、TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征将186例患者进行分组，比较CPNE1蛋白表达水平在各组间存在的差异性。

1.2.2RT-PCR 采用TRIzol试剂盒从肺腺癌组织中提取总RNA进而利用Super Script Ⅲ逆转录酶(美国Invitrogen公司)将总RNA样品用随机引物逆转录成cDNA。设计合成引物进行RT-PCR。引物序列如下：上游5′-ACCCACTCTGCGTCCTT-3′，下游5′-TGGCGTCTTGTTGTCTATG-3′，并以ACTB mRNA作为内参，其引物序列如下：上游5′-CACAGAGC CTCGCCTTTGCC-3′，下游5′-ACCCATGCCCACCAT CACG-3′。所有反应进行3个重复，表达水平通过2-ΔΔCt法分析。

1.2.3Western blot法 分别提取20例肺癌组织和正常肺组织的总蛋白，利用SDS-PAGE变性凝胶电泳等技术进行蛋白分离，经电转、脱脂、封闭、洗涤等步骤，再加入一抗和二抗后，进行光密度积分值分析，进而计算不同组织中的蛋白相对含量。

1.3 统计学分析利用SPSS 20.0软件进行统计学分析，采用χ2检验或Fisher精确检验法进行分析，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肺癌组织和正常肺组织中CPNE1蛋白的表达CPNE1蛋白主要位于人肺腺癌细胞质，同时其在细胞膜中也少量存在，主要呈棕褐色(图1)。在186例肺腺癌组织中有68例呈低表达(36.56%)，118例呈高表达(63.44%)，在30例肺正常组织中均呈低表达。

CPNE1蛋白表达在无远处转移组中的高表达率为58.12%，有远处转移组的高表达率为80.76%；CPNE1蛋白表达在Ⅰ+Ⅱ分期中的高表达率为41.58%，在Ⅲ+Ⅳ分期中的高表达率为84.71%。CPNE1表达与肺腺癌TNM分期(P<0.05)、临床分期(P<0.05)、远处转移(P<0.05)相关。CPNE1与肺腺癌分期、远处转移有关，与患者年龄、性别、肿瘤大小等无关(表1)。

表1 肺腺癌中CPNE1的表达与临床病理特征的相关性[n(%)]

ABC

图1CPNE1在肺腺癌组织和正常肺组织中的表达：A.在肺腺癌组织中低表达；B.在肺腺癌组织中高表达；C.在正常肺组织中低表达，SP法

2.2 正常肺组织和肺腺癌组织中CPNE1基因表达分析对正常肺组织和肺腺癌组织中CPNE1 mRNA表达量进行检测，结果显示20例肺腺癌组织中CPNE1 mRNA表达量均显著高于正常肺组织。该结果与免疫组化结果基本一致，也从另外一个角度验证了肺腺癌组织中CPNE1的表达量高于正常肺组织(图2)。

图2 正常肺组织和肺腺癌组织中CPNE1基因的表达

2.3 正常肺组织和肺腺癌组织中CPNE1蛋白的差异Western blot结果显示，20例肺腺癌组织中CPNE1蛋白含量均显著高于正常肺组织(图3)。该结果与免疫组化及RT-PCR结果基本一致，也从另外一个角度验证了肺腺癌组织中CPNE1蛋白的表达量高于正常肺组织。

图3 Western blot法检测肺腺癌组织和正常肺组织中CPNE1蛋白的表达

3 讨论

肿瘤蛋白质组学研究的重点内容之一是筛选肿瘤与正常组织细胞之间的差异表达蛋白质组，并探寻差异蛋白质的功能[6]。正常组织细胞与肿瘤组织细胞间的差异蛋白表达存在明显差异并会随着肿瘤的发生、发展过程的变化而变化，这些差异性变化也反应在肿瘤发生恶性特征、功能转换、细胞凋亡分化等生物学过程[7-9]，这对于认识肿瘤的发生、发展和癌变机制，筛选寻找高度特异性、敏感性的肿瘤诊断标志物以及新的药物作用靶点提供理论依据，对肿瘤的早期诊断、预防和治疗具有重要的现实意义。本实验采用免疫组化SP法和RT-PCR法从两个角度验证了CPNE1蛋白在肺腺癌组织和正常肺组织间的差异表达，结果表明肺腺癌组织CPNE1的表达量显著高于正常肺组织，CPNE1蛋白表达与肺腺癌淋巴结转移、临床分期有关。CPNE1蛋白表达与肺腺癌的发生、发展及预后密切相关，有望成为肺腺癌预后评估的重要指标。

CPNE1蛋白是Copines家族中最早发现的成员，是由Creutz在研究分离草履虫偶联蛋白时首先发现的[10]。近年众多研究表明，CPNE家族成员与肿瘤的发生发展、膜转运及胞内信号传导等相关。Kulesza等[11]发现CPNE3在非小细胞肺癌中是一种新型的肿瘤转移促进因子，而其在乳腺肿瘤、前列腺肿瘤和卵巢肿瘤中差异蛋白质组学的结果也表明其表达量显著高于正常组织，表明其与上述癌症存在一定的关系。Maitra等[12]发现Copine-4与前列腺的调节和形成具有一定的相关性。Bruin等[13]在研究散发性乳腺癌杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)时发现CPNE7存在于LOH中，表明CPNE7可能具有抑癌基因的作用。CPNE8是一种较晚发现的Copine家族成员，最近研究表明其在前列腺、心脏及脑组织中的表达较为常见[15]，同时，Ramsey等[14]发现其可能是急性髓性白血病癌细胞增殖的负调控因子。

虽然CPNE1是最早发现的Copines家族成员，但对其研究相对较少，而其在肿瘤方面的研究几乎为空白。Yang等[15]在研究人类CPNE1时发现其定位于第20号染色体，编码537个氨基酸，有多种剪切方式。Ghislat等[16]研究发现CPNE1是一种Ca2+依赖结合蛋白，其在自噬体和溶酶体以及内涵体的膜融合过程中起重要的调节作用。Ma等[17]在研究丹酚酸对心脑血管治疗作用时发现，CPNE1可能是细胞骨架蛋白的重要成分，且在信号传导途径中发挥重要作用。

综上所述，本实验从不同角度验证了CPNE1蛋白在肺腺癌组织和正常肺组织间的差异表达，并表明其与淋巴结转移、临床分期有关，CPNE1蛋白表达与肺腺癌的发生、发展及预后密切相关，有望成为肺腺癌预后评估的重要指标，但其具体机制仍需进一步深入探究。