HPLC法测定碳酸钙D3颗粒中维生素D3含量的研究

万 庆，孙 松，许红叶

(1 铜陵市食品药品检验中心，安徽 铜陵 244000；2 合肥远志医药科技开发有限公司，安徽 合肥 230088)

碳酸钙D3颗粒为复方钙补充剂，主要功效为补充人体的钙含量，处方中含有维生素D3，可以促进钙元素在体内的吸收。目前关于维生素D3含量测定方法主要有皂化法[1-3]、提取后氮气吹干复溶法[4-6]，但均存在操作困难及准确性差的问题，本文建立的维生素D3的检测方法操作简易且准确性高，为碳酸钙D3颗粒中维生素D3的含量测定提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪 器

AB135-S十万分之一天平，METTLER TOLEDO；岛津LC-10AD液相色谱仪，苏州岛津公司；Sepax HP-Amino柱(4.6×250 mm，5 μm)；SK1200H超声波清洗器，上海科导超声仪器有限公司；水浴恒温振荡器，江苏金坛市金城国胜实验仪器厂；TDL-80-2B台式离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.2 试 药

正己烷、异丙醇为色谱级，二甲亚砜、2,6-二叔丁基对甲酚为分析级，水为屈臣氏纯净水；维生素D3对照品(批号：100061-201208，纯度99.8%)，中国食品药品检定研究院；碳酸钙D3颗粒(生产批号：20180306、20180307、20180308)，北京康远制药有限公司。

2 方法与结果

2.1 色谱条件

采用Sepax HP-Amino(250×4.6 mm,5 μm)色谱柱；以正己烷-异丙醇(99:1)为流动相；检测波长:265 nm；柱温：30 ℃；流速：1.5 mL·min-1；进样量：500 μL。在上述色谱条件下，维生素D3的理论塔板数为15012.361，对称因子为1.102。

2.2 溶液的制备

2.2.1 对照品储备溶液的制备

精密称取维生素D3对照品25.23 mg，加入0.02% 2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液25 mL，混匀，作为对照品贮存液1#，精密量取对照品贮存液1#1 mL加0.02% 2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液20 mL，混匀，作为对照品贮存液2#。

2.2.2 供试品溶液的制备

取本品25袋内容物，精密称定，计算每袋平均装量，研细，精密称取细粉适量(约相当于维生素D3 25 μg)，置100 mL棕色量瓶中，加溶液[用二甲基亚砜-水(10:2)混合溶液制成每1 mL中含2,6-二叔丁基对甲酚(Butylated hydroxytoluene; BHT)0.2 mg的溶液] 50 mL，超声振荡15 min，并时时振摇，保持超声水浴温度不超过30 ℃，精密加0.02% 2，6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液25 mL，振摇15 min后，离心5 min(4000 rpm)，分取上层溶液，避光静置1 h后得澄清溶液，作为供试品溶液。

2.3 系统适用性实验

取碳酸钙D3颗粒，按“2.2.2”项方法制得系统适用性溶液，注入液相色谱仪中，记录色谱图(见图1)。

图1 系统适用性实验色谱图

2.4 专属性实验

按碳酸钙D3颗粒处方制备不含维生素D3的阴性空白样品，按“2.2.2”项方法制得阴性对照溶液，用于方法的基质干扰实验。分别对维生素D3对照品、供试品溶液及阴性对照溶液进样分析，考察样品处方中辅料对维生素D3色谱峰是否有干扰。结果：样品中辅料对维生素D3色谱峰无干扰。为进一步考察方法的专属性，将碳酸钙D3颗粒样品分别进行高温、光照、酸化、碱化和氧化条件下进行了强制性的降解实验，以排除各条件下的降解产物对维生素D3色谱峰的干扰。精密称取碳酸钙D3颗粒10 g，按“2.2.2”项方法制得供试品溶液，取上述供试品溶液3 mL于80 ℃水浴中加热6 h，冷却值室温，作为供试品溶液。取上述供试品溶液3 mL，加入100 μL 30% H2O2溶液，放置6 h后，作为供试品溶液。取上述供试品溶液3 mL加入50 μL三氟乙酸，放置5 min后，加入50 μL二乙胺中和至中性，作为供试品溶液。取上述供试品溶液3 mL加入100 μL二乙胺，放置8 h后，加入100 μL三氟乙酸中和至中性，作为供试品溶液。将各条件下供试品溶液注入高效液相色谱仪中。结果维生素D3在酸化时峰面积下降，说明有降解发生，不稳定，其余条件峰面积基本无变化(见图2)。

图2 专属性实验(A-H)

2.5 线性关系考察

精密量取对照品贮存液2# 2 mL，加入0.02% 2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液50 mL，即得对照品贮存液3#。分别精密量取对照品贮存液3# 2、4、5、6、8 mL，分别置10 mL量瓶中定容，摇匀，作为各对照品溶液。取各浓度的对照品溶液，依次由低浓度至高浓度注样，各浓度平行注样2针，取峰面积平均值。以峰面积为纵坐标，浓度(μg/mL)为横坐标，进行线性回归分析，得野黄芩苷线性回归方程：A=1137838.405×C-19848.177(R=0.9995，n=5)。结果表明：维生素D3在0.40～1.60 μg/mL的浓度范围内与峰面积积分值呈良好的线性关系。

2.6 精密度考察

取维生素D3对照品贮存液1#，精密吸取500 μL，连续进样6次，测定各自峰面积积分值，计算维生素D3峰面积的RSD为0.88%，充分说明本仪器精密度良好。

2.7 稳定性实验

取同一份供试品溶液，在配置后于室温放置0、2、4、6、8 h，分别精密进样500 μL，最终维生素D3的峰面积积分值保持稳定，RSD为1.00%，结果表明：供试品溶液中维生素D3在室温放置8 h内基本稳定。

2.8 重复性实验

取同一批次的碳酸钙D3颗粒样品，按照“2.2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，分别精密进样500 μL，记录每份供试品溶液维生素D3成分的峰面积并进行含量计算。结果维生素D3的含量RSD值为0.50%，表明方法重复性良好。

2.9 回收率实验

表1 回收率实验结果

如表1所示，精密称取维生素D3对照10.43 mg、12.54 mg、15.03 mg，加入0.02% 2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液10 mL，混匀，作为对照品贮存液，精密量取对照品贮存液1 mL 加0.02% 2,6-二叔丁基对甲酚的正己烷溶液50 mL，混匀，分别制得浓度为20.82 μg/mL、25.01 μg/mL、30.00 μg/mL的对照品贮存液。精密称取阴性样品10 g，分别加入不同浓度的对照品贮存液1 mL，按“2.2.2”项下方法制备相当于80%、100%、120%浓度的样品溶液，每个浓度平行制备3份样品，分别精密进样500 μL，记录每份供试品溶液维生素D3成分的峰面积并进行回收率计算，测得平均回收率为99.0%，RSD=1.50%。

2.10 样品的含量测定

分别测得三批碳酸钙D3颗粒样品，按“2.2.2”项下的方法制备供试品溶液，在上述色谱条件下分别精密进样500 μL，记录每份供试品溶液维生素D3成分的峰面积并进行含量计算。三批样品结果分别为99.10%、102.31%、98.77%。

3 结 论

通过对维生素D3紫外波长扫描，结果维生素D3在265nm处有最大吸收，因而选择265nm作为检测波长。通过耐用性考察，分别对波长、柱温、流速进行考察，最终得到最佳的色谱条件，确保制剂中维生素D3的色谱峰分离度、理论塔板数及保留时间均达到要求。通过进行方法学验证中强制降解实验得知。样品中的维生素D3在加酸条件下有所降解，产生的降解物在已建立的色谱条件下均未见明显的色谱峰，不干扰样品中的维生素D3的测定。

本文建立了在碳酸钙D3颗粒中维生素D3的含量测定方法，检测方法操作简单，对设备要求低，检测结果的重现性良好，专属性强，对含有维生素D3的制剂提供一种新的检测方法。