SIRT1在NMDA诱导的肺泡上皮细胞损伤中的保护作用*

杜航航 吴治红 陶家荣 赵四俊 马帅志 彭湘萍

吉首大学医学院 1 临床医学系16级 2 生理教研室, 湖南省吉首市 416000

急性肺损伤(ALI)是指在炎症感染、休克等致伤因素作用下，肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤造成弥漫性肺间质及肺泡水肿，这些变化导致肺容积减少、肺顺应性降低、严重的通气/血流比例失调，最终可引起急性呼吸功能不全，其发病率和死亡率较高[1]。

沉默信息调节因子1(SIRT1)是一种Ⅲ型去乙酰化酶，其参与细胞衰老、抗氧化应激、抑制炎症反应和能量代谢调节等多种细胞功能活动[2]。大鼠肠道缺血再灌注诱导的急性肺损伤中，肺部 SIRT1 表达降低而肺 TNF-α、IL-6、IL-1β水平的上升，这些研究提示SIRT1在肺部炎性反应中扮演重要角色[3]。

N-甲基-D-天冬氨酸(NMDA)受体属于离子型谷氨酸受体，广泛表达于中枢神经系统，在兴奋性突触传递及学习记忆中起关键作用。近年来研究表明NMDA受体也分布于非神经组织和细胞中，包括：肺脏、肾脏、胰岛β细胞、血管[4]。特异性阻断NMDA受体可通过抑制炎症反应有效减轻高氧所致的急性肺损伤[5]，这表明NMDA受体过度激活在肺损伤的发生发展中可能起重要作用。

本实验旨在观察SIRT1在NMDA受体激活引起的肺上皮细胞损伤中的保护作用，为治疗相关肺部疾病提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料 小鼠肺上皮细胞(MLE-12)购买于美国 ATCC 细胞库；细胞培养基及胎牛血清(Gibco)；白藜芦醇(RSV)及NMDA(Sigma)；LDH测定试剂盒(南京建成公司)；CCK-8测定试剂盒(碧云天生物公司)；ELISA试剂盒(武汉华美公司)；SIRT1多克隆抗体及二抗(博士德)；其他试剂均为国产分析纯。

1.2 方法

1.2.1 分组：将肺上皮细胞MLE-12放置于5%CO2，37℃的细胞培养箱中进行培养，细胞生长达70%～80%密度时进行消化传代。将细胞接种到细胞培养板中，采用NMDA损伤细胞建模，SIRT1激动剂RSV(DMSO溶解)进行干预。分组如下：(1)Con组(正常对照组，加入等体积DMSO)；(2)NMDA组(加入500μM NMDA处理)；(3)NMDA+RSV(加入500μM NMDA及10μM RSV共处理)；(4)RSV(加入10μM RSV处理)。各组样本数为6，加入处理因素后继续孵育24h。

1.2.2 CCK-8法检测细胞活力：调整肺泡上皮细胞MLE-12细胞悬液浓度为1×105个/ml，加入96孔板内，当细胞培养板内细胞融合度达到50%～60%时，即可开始进行药物处理。24h后，每孔内加入含CCK-8溶液 20μl，混匀后继续培养1h后，用多功能酶标仪测定 450nm 处的吸光度。

1.2.3 细胞培养液中LDH活性检测：取细胞培养液，按照试剂盒说明书进行操作，用多功能酶标仪测定450nm处的吸光度，根据标准品活力计算样本中LDH活性。

1.2.4 ELISA检测细胞培养液中TNF-α、IL-6水平：收集细胞上清液，采用ELISA方法测定细胞培养液中TNF-α、IL-6含量，严格按照试剂盒说明书进行测定，酶标仪450nm波长测定吸光度，绘制标准曲线后计算各组TNF-α、IL-6浓度。

1.2.5 Western Blot检测SIRT1表达：药物处理结束后，肺上皮细胞用预冷RIPA细胞冰上裂解, 于4℃、12 000r/min条件下离心10min, 吸取上清, 用BCA法浓度样本蛋白含量。加入蛋白上样缓冲液，煮沸5min进行蛋白变性。取5μg蛋白上样量, 在12%聚丙烯酰胺凝胶电泳2h, 再电转移到活化的PVDF膜上, 室温下封闭2h，加入一抗于4℃冰箱中过夜。次日用TBST缓冲液洗净一抗, 再用含辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育2h, TBST缓冲液洗净二抗, 最后用ECL发光剂进行检测, 曝光、显影。GAPDH为蛋白内参。

1.3 统计学方法 采用SPSS17.0统计软件对数据进行统计学分析。计量资料以Mean±SEM表示，多组间均数比较采用析因分析(one-way ANOVA)，P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 RSV对NMDA所致细胞活力的影响 采用CCK8检测各组细胞活力变化。结果显示，与正常对照组(Con)比较，NMDA组细胞活力下降(P<0.01)。与NMDA组比较，NMDA+RSV组细胞活力较NMDA组增加(P<0.05)，单独RSV组与对照组比较没有明显差别。见图1。

图1 RSV对NMDA诱导的细胞活力的影响

注：**与Con组比较，P<0.01;#与NMDA组比较，P<0.05。

2.2 RSV对细胞培养液中LDH活性的影响 正常情况下，LDH广泛分布于机体各个组织细胞的细胞浆中,当细胞受到刺激出现损伤，细胞膜通透性增加时，LDH释放进入组织液中。与正常对照组(Con)比较，NMDA组培养液中LDH活性明显增加(P<0.01)。与NMDA组比较，NMDA+ RSV组LDH活性较NMDA组降低(P<0.01)。单独RSV组与对照组比较没有明显差别。见图2。

图2 RSV对NMDA诱导的细胞LDH释放的影响

注：**与Con组比较，P<0.01;##与NMDA组比较，P<0.01。

2.3 RSV对细胞培养液中TNF-α，IL-6含量的影响 与正常对照组(Con)比较，NMDA组培养液中TNF-α、IL-6含量明显增加(P<0.01)。与NMDA组比较，NMDA+ RSV组TNF-α、IL-6含量较NMDA组降低(P<0.05)。单独RSV组与对照组比较没有统计学差别。见图3。

2.4 各组细胞中SIRT1蛋白的表达比较 采用Western Blot检测各组SIRT1表达水平，结果显示：与正常对照组(Con)比较，NMDA处理组SIRT1蛋白水平低于对照组(P<0.05)，而NMDA+ RSV组SIRT1蛋白表达水平较NMDA组增加(P<0.05)。单独RSV组与对照组比较没有统计学差别。见图4。

图3 RSV对NMDA诱导的细胞炎症因子含量的影响

注：A：TNF-α含量；B：IL-6含量。**与Con组比较，P<0.01;#与NMDA组比较，P<0.05。

图4 RSV对NMDA诱导的细胞SIRT1蛋白表达的影响

注：*与Con组比较，P<0.05;#与NMDA组比较，P<0.05。

3 讨论

兴奋性神经递质谷氨酸(Glu)在中枢神经系统具有重要作用，其作用主要通过NMDA受体所介导。但是，NMDA受体的过度激活会导致兴奋性毒性引起细胞坏死或凋亡。据报道，外周肺组织同样也存在NMDA受体，并参与急性肺损伤和肺泡炎症反应。高浓度NMDA(1mM)可引起离体大鼠肺组织水肿[6]。腹腔注射NMDA可引起小鼠急性肺损伤，激活NMDA受体能够上调肺泡巨噬细胞炎性因子TNF-α、IL-6的表达并促进其分泌[7]。肺上皮细胞是肺部抵御损伤的一道防线，肺上皮细胞损伤是急性肺损伤的一个重要的发病机制。肺损伤发病过程中，肺部炎性反应激活，多种炎性因子大量释放，导致肺上皮屏障破坏。本研究结果表明，500μM NMDA 处理肺上皮细胞MLE-12,可引起细胞活力下降，细胞培养液中LDH 活性升高，同时细胞培养液中炎性因子TNF-α、IL-1β 含量增多，提示成功构建了NMDA诱导的肺泡上皮细胞损伤模型。

核定位的SIRT1其能参与细胞去乙酰化, 可通过多条信号通路参与机体代谢, 调控细胞分化、增殖、凋亡及抑制炎症等[8]。研究指出, 在炎症反应中, SIRT1通过降低NF-κB p65的乙酰化水平, 从而抑制其对于下游炎症因子的转录[9]。炎症因子的大量合成与释放是急性肺损伤的重要特征及病理改变之一，上皮细胞在受到外来刺激时可大量合成并分泌TNF-α，后者可刺激邻近细胞产生大量的趋化因子，并介导炎症反应发生。SIRT1具有抗炎并抑制细胞间黏附分子表达的作用, 当炎性反应途径激活转录因子NF-κB, 刺激线粒体产生大量氧自由基, 而SIRT1则通过抑制其与NF-κB启动子的结合, 从而干扰NF-κB信号转导，最终起到抗炎作用[10]。文献报道，SIRT1是急性肺损伤的潜在治疗靶点，熊果酸通过上调SIRT1的表达拮抗NF-κB 介导的炎症反应，显示出强大的抗炎作用[11]。白藜芦醇(RSV)是目前较强的激活SIRT1的植物化合物。文献报道，RSV上调肺泡上皮细胞中SIRT1的表达，减少ROS的产生从而减轻高氧所致肺损伤[12]。本研究通过加入RSV观察细胞炎症损伤的改变。结果显示，500μM NMDA处理下调MLE-12细胞SIRT1的蛋白表达。同NMDA组比较，NMDA+ RSV组MLE-12细胞损伤程度低，活力增加，炎性因子TNF-α、IL-6含量降低且SIRT1的蛋白表达增加。结果提示炎性反应降低与SIRT1表达上调有关。实验的结果表明，SIRT1的激活减轻了NMDA诱导的肺泡上皮细胞损伤的炎症反应。

综上所述，在NMDA诱导的肺泡上皮细胞损伤中，激活SIRT1可降低培养液中炎症因子TNF-α和IL-6水平，减轻NMDA诱导的细胞损伤，具有明显的细胞保护作用，该研究可为NMDA诱导的肺损伤治疗提供新的理论及实验支持。