肝再生磷酸酶-3抗体联合培美曲塞促进人肺腺癌细胞系A549的凋亡

盛 馨，刘 单，邓述恺

(西南医科大学附属医院 呼吸与危重症医学一科，四川 泸州 646000)

肺癌(lung cancer)发病率及病死率逐年上升，居全世界众癌之首[1]。肺癌治疗方式包括手术、放疗、化疗、分子靶向及免疫治疗等。铂类药物与第3代细胞毒药物(如培美曲塞)联合化疗是晚期非小细胞肺癌标准一线治疗方案。如何增强化疗药物疗效成为医学研究难点。肝再生磷酸酶(phosphatase of regenerating liver，PRL)是一类癌基因编码的核蛋白酪氨酸磷酸酶，包括PRL-1、PRL-2、PRL-3。PRL-3在多种恶性肿瘤中高表达，并与肿瘤转移明显相关[2-3]。本实验主要研究培美曲塞(pemetrexed,Pem)和PRL-3抗体单药及联合用药对人肺腺癌细胞系A549增殖、迁移及凋亡的作用，初步探索其可能的机制，以期为临床上增强培美曲塞疗效提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 材料及试剂

人肺腺癌细胞系A549(human lung adenocarcinoma cell line A549)(西南医科大学中心实验室)；培美曲塞(Pem)(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；PRL-3抗体(R&D Systems公司)；胰蛋白酶、PBS(磷酸盐缓冲溶液)及D-Hanks(吉诺生物医药技术有限公司)；胎牛血清(杭州天杭生物科技有限公司)；1640培养基(HyClone公司)；CCK-8试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)； Annexin-FITC细胞凋亡检测试剂盒(天津三箭生物技术有限公司)；Transwell板(Corning公司)；磷酸化蛋白酶抑制剂、DMSO、SDS-PAGE凝胶制备试剂盒(ASPEN公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞的培养与分组：将含10%胎牛血清的1640培养基置于37 ℃、5% CO2饱和湿度恒温培养箱培养A549细胞，取对数增殖期细胞用于实验。分组：1)对照组，包括空白对照组(无药物干预组)及DMSO组(加入与PRL-3抗体同浓度的DMSO)；2)实验组，包括PRL-3抗体组(164 ng/mL)、培美曲塞组(根据前期预实验结果及查阅文献[4]取24 h IC50:180 ng/mL)和PRL-3抗体(164 ng/mL)+培美曲塞(180 ng/mL)联合用药组，各组细胞分别作用24 h后用于后续实验。

1.2.2 CCK-8法检测细胞增殖：PRL-3抗体浓度分别设为0、2.5、5、10、20、40、80、160和320 ng/mL。取对数增殖期细胞铺96孔板，细胞贴壁后弃培养液，加入100 μL上述药物浓度培养基,每个浓度均有5个复孔。分别培养24 h后，所有孔加入10 μL CCK-8溶液，培养箱中孵育4 h。酶标仪测450 nm吸光度值，计算PRL-3抗体IC50及各组细胞增殖抑制率,将测得的PRL-3 IC50用于后续实验。细胞增殖抑制率=(对照组-实验组)/(对照组-空白组)×100%。

1.2.3 Transwell小室法实验检测细胞迁移能力：收集细胞悬液于Transwell小室，将小室放入24孔板。取出小室，弃培养基并将细胞擦除干净,结晶紫染色10 min,洗去表面结晶紫，拍照并计数迁移细胞数。

1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡率：制备细胞悬液，用结合缓冲液重悬，加入annexin V-FITC，混匀后避光孵10 min，再加入PI，混匀后避光孵育5 min。1 h内流式细胞仪上机检测，每组测3个样本，选择相应通道观察。

1.2.5 Western bolt检测PRL-3、P-ERK和VEGF蛋白表达:提取细胞总蛋白，测定样品蛋白浓度，取样品至每孔40 μg蛋白，加入5×蛋白上样缓冲液，100 ℃沸水浴5 min。然后，制胶-上样-电泳-转膜-封闭1 h-一抗4 ℃过夜-二抗室温30 min-ECL反应-暗室曝光。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 不同浓度PRL-3抗体对A549细胞增殖抑制率的影响

与对照组相比，PRL-3抗体随浓度增加，对A549细胞增殖的抑制作用增加(P<0.01)；实验测得PRL-3抗体IC50为164 ng/mL，将该浓度作为实验浓度用于后续实验(表1)。

表1 CCK-8法检测不同浓度PRL-3抗体对A549细胞增殖的影响

*P<0.05 compared with control group[PRL-3(0.00)]; PRL-3.PRL-3 antibody.

2.2 PRL-3抗体联合培美曲塞(Pem)对A549细胞增殖抑制率的影响

各实验组细胞增殖抑制率明显高于对照组(P<0.05)，且联合用药组细胞增殖抑制率明显高于PRL-3抗体及培美曲塞(Pem)单药组(P<0.05)(表2)。

表2 各组人肺腺癌A549细胞作用24 h后增殖抑制率比较

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with PRL-3 antibody group；△P<0.05 compared with pemetrexed group; PRL-3.PRL-3 antibody.

2.3 PRL-3抗体联合培美曲塞(Pem)对A549细胞迁移的影响

各实验组迁移细胞数明显低于对照组(P<0.05)；联合用药组迁移细胞数明显低于PRL-3抗体及培美曲塞(Pem)单药组(P<0.05)(图1,2)。

图1 PRL-3抗体及培美曲塞对A549细胞迁移的影响Fig 1 Effects of PRL-3 antibody and Pem on migration of A549 cells(×100)

*P<0.05 compared with control group； #P<0.05 compared with PRL-3 antibody group；△P<0.05 compared with Pem group; PRL-3.PRL-3 antibody图2 各组A549细胞作用24 h后迁移细胞数比较Fig 2 Comparison of the number of migration cells of human lung adenocarcinoma A549 cells treated for 24 hours in each

2.4 PRL-3抗体联合培美曲塞(Pem)对A549细胞凋亡的影响

各实验组凋亡率明显高于对照组(P<0.05)；联合用药组凋亡率明显高于PRL-3抗体及培美曲塞(Pem)单药组(P<0.05)(图3,4)。

2.5 PRL-3抗体联合培美曲塞(Pem)对PRL-3、P-ERK和VEGF蛋白表达的影响

各实验组PRL-3、VEGF和P-ERK蛋白表达水平明显低于对照组(P<0.05)；联合用药组PRL-3、VEGF和P-ERK蛋白表达水平明显低于PRL-3抗体及培美曲塞(Pem)单药组(P<0.05)(图5,6)。

3 讨论

培美曲塞(Pem)可导致核苷酸合成和叶酸代谢异常，从而抑制肿瘤细胞增殖[5]。培美曲塞(Pem)可介导ERK相关信号途径诱导肺癌细胞凋亡[6-7]。但关于培美曲塞是否可通过调节PRL-3蛋白表达进而影响A549细胞生物学效应的相关报道较少。

PRL-3在多种恶性肿瘤中高表达[8-9]，且淋巴结及转移灶表达水平明显高于原发灶及正常组织。PRL-3抗体是针对PRL-3的特异性抗体,特异性强,亲和力高。PRL-3可在体外调节乳腺癌细胞增殖和侵袭[10]，可促进经典霍奇金淋巴瘤及急性淋巴细胞白血病细胞生存和迁移[11-12]。但关于PRL-3在肺癌中的报道较少，本实验发现PRL-3抗体及培美曲塞单药及联合用药均能明显抑制A549细胞增殖、迁移并促进细胞凋亡，且联合用药组抑制A549细胞增殖、迁移及促进细胞凋亡作用大于单药组。

图3 各组A549细胞作用24 h的凋亡率Fig 3 Apoptotic rate of A549 cells treated for 24 hours in each group

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with PRL-3 antibody group；△P<0.05 compared with Pem group; PRL-3.PRL-3 antibody图4 各组人肺腺癌A549细胞作用24 h的凋亡率比较Fig 4 Comparison of apoptotic rate of lung adenocarc- inoma A549 cells treated for 24 hours in each

A.control; B.DMSO; C.PRL-3 antibody; D.Pem; E.PRL-3 antibody+ Pem图5 各组A549细胞作用24 h后PRL-3、VEGF和P-ERK蛋白表达Fig 5 Expression of PRL-3, VEGF and P-ERK protein in A549 cells treated for 24 hours in each group

*P<0.05 compared with control group；#P<0.05 compared with PRL-3 antibody group；△P<0.05 compared with Pem group; PRL-3.PRL-3 antibody图6 各组A549细胞作用24 h后PRL-3、VEGF和P-ERK蛋白相对表达量比较Fig 6 Comparison of the relative expression of PRL-3, VEGF and P-ERK protein in A549 cells treated for 24 hours in each

ERK是将信号从表面受体传导至细胞核的关键，参与细胞增殖、凋亡和癌变等多种生物学效应[13]。PRL-3可诱导ERK磷酸化增加肿瘤细胞新生血管及淋巴管形成，促进肺癌细胞淋巴结及远处转移[14]。下调PRL-3可抑制胶质瘤细胞通过ERK/JNK/MMP7增殖、侵袭和迁移[15]。上述研究表明抑制PRL-3可能通过抑制P-ERK/VEGF通路产生抗肿瘤效应。与上述结果类似，本实验发现各实验组PRL-3、VEGF和P-ERK蛋白表达水平明显低于对照组；联合用药组PRL-3、VEGF和P-ERK蛋白表达水平明显低于单药组。本实验结果提示抑制A549细胞PRL-3蛋白表达，可下调P-ERK及VEGF蛋白表达。本实验同时提示PRL-3抗体和培美曲塞可抑制PRL-3、P-ERK和VEGF蛋白表达，且联合用药组对PRL-3、VEGF和P-ERK蛋白表达抑制大于单药组。表明PRL-3抗体可能通过抑制PRL-3、VEGF和P-ERK蛋白表达增强培美曲塞抗肿瘤效应。

综上所述，本实验表明PRL-3抗体可增强培美曲塞对体外人肺腺癌细胞系A549增殖、迁移的抑制作用及促凋亡作用，其可能机制：抑制PRL-3/P-ERK/VEGF通路相关蛋白。PRL-3对判定非小细胞肺癌生物学行为和预后有重要意义，PRL-3抗体联合培美曲塞有望成为治疗非小细胞肺癌的新方法。但本实验有一定局限性，PRL-3可能不仅仅通过P-ERK调控VEGF影响A549细胞生物学行为，且本实验未经动物模型验证，需进一步体内实验及临床实验验证。