高速离心方案对乙型肝炎病毒回收效果分析*

刘 晓，欧国进，刘 忠△

(1.德阳市人民医院检验科，四川德阳 618000；2.中国医学科学院输血研究所，四川成都 610052)

从核酸检测开始推行后，乙型肝炎病毒(HBV)的传播风险已经大大降低[1]，但该检测方法不能100%阻断HBV经血传播，原因之一为核酸检测试剂与免疫学检测方法一样有自己的检测下限，大多数HBV核酸检测试剂的灵敏度在28 copy/mL以上，当病毒水平低于该检测下限时，如隐匿性乙型肝炎感染或病毒感染窗口期，病毒水平通常<112 copy/mL，隐匿性乙型肝炎感染标本的平均载量为78.4 copy/mL，但有时病毒载量低于28 copy/mL[1]，这时核酸检测就可能出现漏检。目前报道的输血传播疾病的残余风险主要还是输血感染HBV[3-4]。窗口期及隐匿性感染已经成为阻碍血液安全推进的主要瓶颈。另一方面，由于核酸检测成本昂贵，为了降低成本，目前的检测中心大都使用多人份混检[6-8]，HBV核酸混样检测策略因单个取样量变少而不能确保发现所有的低载量窗口期感染标本。如果在献血者的筛查中未检测出这种极低水平的病毒滴度，可能会导致严重后果[9]，已有报道称因输注了未能检测到HBV-DNA的血液而感染HBV[10]。为了解决该问题，有研究者提出了病毒浓缩，即在多人份混检(也可用于单检)情况下，加大单个标本取样量，然后运用离心技术将HBV病毒沉淀下来，提高病毒水平，从而提高检测灵敏度。但目前报道的离心力从(15 000～266 000)×g不等[11-12]，离心时间也各不相同，这就导致了病毒回收差异大，不能准确提供离心力及离心时间与HBV回收率的关系。本文就以上问题，研究离心力与离心时间对HBV回收率的影响，为大家提供理论基础。

1 资料与方法

1.1一般资料 HBV标准品为定量标准品S1、S2、S3，定量值分别为1.65×108、2.58×107、1.37×106copy/mL。混样所用阴性标本为德阳市血液中心提供的丙氨酸氨基转移酶异常的报废血，实验室经核酸检测HBV、丙型肝炎病毒、人类免疫缺陷病毒均为阴性，同时其乙型肝炎表面抗原、丙型肝炎抗体、人类免疫缺陷病毒抗体、梅毒抗体也均为阴性。所有标本于-20 ℃保存。

1.2仪器与试剂 病毒总核酸提取试剂盒购自德国Qiagen公司，货号51106；超高速离心机及超高速离心管购自美国贝克曼公司；小量核酸提取仪购自美国Thermo公司；荧光定量PCR仪购自美国ABI公司，型号7900HT；HBV标准品购自中国北京康彻思坦生物技术有限公司。

1.3方法 取4个容量为1 L的玻璃瓶，洗净烘干泡酸后进行高压灭菌处理，待冷却后每瓶加入900 mL的阴性血浆，然后再加入650 μL的S3 HBV标准品(水平为1.37×106copy/mL)，上下颠倒充分混匀(不少于20次)制成原倍血浆。此时，每瓶HBV理论水平为985.6 copy/mL。将混匀的HBV标本用无菌一次性注射器分装至264个离心管中，每管分装13 mL(理论容量为13.5 mL)，经称量平衡后将管口密封。另取6个离心管只分装阴性血浆，作为阴性对照，共270管。

1.3.1离心力与离心时间的双因素交互分析设计 将264个阳性离心管按离心力(15 000～171 000)×g与离心时间0.5～2.0 h分成44组，每组做6个平行管。每组按相应条件进行4 ℃低温高速离心，离心后弃上清留病毒沉淀，沉淀用200 μL的磷酸盐缓冲液吹打混匀，并转移到1.5 mL的离心管中，准备后续提取及扩增检测(若不能及时进行提取，可于-20 ℃保存)。6个阴性对照随机与实验组一同处理。另取6个离心管，每管取200 μL的原倍血浆作为原始水平对照，与离心处理后的标本同时进行提取、扩增、检测。计算离心浓缩后的病毒水平及回收率。

1.3.2HBV-DNA提取 对含200 μL原倍血浆或经离心处理后的200 μL的浓缩液进行提取，提取使用凯杰过柱法，同时提取5个标准品，提取用量为200 μL。

1.3.3HBV-DNA扩增及检测 使用实验室HBV荧光定量检测方法，HBV上游引物:5′-ATG TGT CTG CGG CGT TTT ATC-3′,下游引物:5′-ACA MAC GGG CAA CAT ACC TT-3′。探针:FAM-CAT CCT GCT GCT ATG CCT CAT CTT CT-HBQ。25 μL反应体系:2×Taq PCR Master Mix 12.5 μL，正反向引物各0.5 μL，探针0.4 μL，DNA模板 4 μL，双蒸水7.1 μL，采用荧光定量PCR仪进行检测。程序设置:95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，45个循环，荧光收集在60 ℃。

1.3.4引入高速离心浓缩技术后的灵敏度验证 取S3标准品分别制备成11.2 copy/mL及5.6 copy/mL的HBV标准品。取8个超高速离心管，每管加入2 mL的11.2 copy/mL的血浆，然后用阴性血浆加满离心管，另取8个离心管，每管加入4 mL的5.6 copy/mL的血浆，然后用阴性血浆加满离心管。再取2个离心管分装阴性血浆，作为阴性对照。称量配平后封管，107 000×g离心1 h后弃上清，重悬沉淀，200 μL溶液提取DNA，步骤同1.3.2。HBV扩增及检测同步骤1.3.3。另各取2份200 μL的未离心原标本与离心后标本一同提取DNA及后续扩增检测。

1.4统计学处理 该结果所有数据均由SPSS12.0软件进行处理，各组间数据的比较依据资料的性质,采用t检验和双因素方差分析，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结 果

2.1不同高速离心方案的检测结果及回收率 阴性对照管检测结果均为阴性。HBV原倍血浆检测结果的均值为941.36 copy/mL(理论水平为985.6 copy/mL)，回收率为95.5%。见表1、图1。

2.2离心时间对HBV回收率的影响 经SPSS12.0软件分析，P=0.352，不拒绝原假设，认为时间对回收率没有明显影响。即在任意固定的离心力下，离心时间的差异对病毒回收影响不大。

表1 不同离心力与离心时间的检测结果(copy/mL)

图1 不同离心时间、离心力下的HBV回收率

2.3离心力对HBV回收率的影响 经SPSS12.0统计软件分析，P=0.000，拒绝原假设，认为离心力对回收率有明显影响。(15 000～90 800)×g之间任意2组比较差异均有统计学意义(P<0.05)，即在这个范围内，HBV回收率随着离心力的增加而增加，回收率在(41.4±7.5)%～(83.8±9.5)%。离心力在(908 00～171 000)×g，任意2组比较差异均无统计学意义(P>0.05)，即在这个范围内，回收率相对稳定，达71.6%～102.9%。

表2 低载量标本高速离心处理后定量结果

注:A表示HBV水平为5.6 copy/mL的扩增曲线；B表示HBV水平为11.2 copy/mL的扩增曲线。

图2 高速离心后的效果验证

2.4离心力、离心时间的交互作用对HBV回收率的影响 经SPSS12.0统计软件分析(双因素交互方差分析)，该结果P=1.000，不拒接原假设，无证据表明交互作用对回收率有显著影响，即说明这2个因素是相互独立的，没有交互作用。

2.5高速离心处理低载量标本后的效果验证 离心条件:107 000×g，4 ℃离心1 h。阴性对照均无扩增曲线，未离心原标本均未检出，见表2、图2。

3 讨 论

中国是乙型肝炎大国，严重威胁到血液安全。在HBV感染的“窗口期”、免疫静默感染、隐匿性感染及自限性感染末期的携带者可能出现极低水平的HBV-DNA，低水平HBV-DNA的患者体内可能存在着肝脏的持续性损伤和病毒复制，一旦发生漏检就会严重影响临床诊治和输血安全，应引起高度重视。这时想要准确检测到病毒载量，不仅与灵敏度高的检测试剂有关，还与取样概率有关，因为HBV病毒在人体中呈现泊松分布[2,13]，如果取样量过低，就会出现假阴性情况，尤其是在多人份混检时(相当于将标本稀释)，这种情况更加明显。

本文基于已报道过的离心力及离心时间，通过一系列的离心力及离心时间来研究HBV回收率及其关系。根据实验结果显示，离心力是影响回收率的最大因素，当离心力在(15 000～908 00)×g时，随着离心力的增加，回收率也从41.4%上升到83.8%，且各组间比较差异有统计学意义(P<0.05)。而后随着离心力在一定范围内[(90 800～171 000)×g]增加，病毒回收率相对恒定，维持在82.5%～87.9%，各组之间比较差异均无统计学意义(P>0.05)。当离心力过大时(171 000×g)，回收率有下降趋势，可能原因是离心力过大，沉淀物与管壁黏附较牢固，洗脱不充分，导致回收率下降。又或是离心力大而沉淀了过多的杂质，抑制了检测步骤中荧光定量PCR的反应，不排除操作误差导致了数据的偏差。离心时间、离心力与时间交互作用对回收率影响不大，实际工作中考虑到时间效益，可以选择0.5 h的离心时间。

按本次实验中的80%回收率计算，当进行n(n≥2)倍离心浓缩时，则病毒水平提高0.8n倍，即可以提高检测试剂盒的灵敏度0.8n倍。例如试剂盒的灵敏度为224 copy/mL，而标本HBV水平为28 copy/mL，进行10倍浓缩时(若不进行离心浓缩，将可能出现漏检)，标本水平可提高至224 copy/mL，从而达到检测试剂盒的灵敏度(相当于试剂盒检出下限可达28 copy/mL)，可以减少因试剂盒灵敏度不够而导致的漏检。为了验证该结论，笔者将HBV标准品分别稀释至11.2 copy/mL、5.6 copy/mL，按80%的回收率计算，则11.2 copy/mL的标本需进行10倍浓缩，即将取样量增加至2 mL，才能达到本实验室HBV检测试剂的灵敏度(90.72 copy/mL)，对应的5.6 copy/mL的标本需20倍浓缩，即4 mL取样量，然后经超高速离心(90 800～171 000)×g 1 h后检测标本。结果显示检出率均为100%。

目前国内有一些关于HBV浓缩的文章,1篇在20 000×g离心30 min时的浓缩效率高达90%以上[12]，与本文差距较大，原因为该文中使用了聚乙二醇浓缩剂，其可以减少病毒分子间距，使其快速沉淀下来，大大增加了浓缩效率，但该法加入外来试剂，易引起污染，且聚乙二醇试剂加入量为总容量的50%，这样不能处理多混样的大容量标本。而其他研究中，24 600×g离心1 h时HBV的回收率在40%～90%[13-14]，回收差异大，而且使用的离心机为高速台式冷冻离心机，一次只能处理小容量的标本，并不适用于大容量标本浓缩。本法不需要加入外来试剂，有效避免污染，且适用于大容量标本或者多标本的处理。

4 结 论

高速离心技术可使HBV检出率提高，通过适当增加标本量，可检出低至5.6～11.2 copy/mL甚至更低的HBV病毒载量。