1 664例不孕症女性人乳头瘤病毒感染基因亚型分析*

2020-05-29曾青红周志辉李梅芳

国际检验医学杂志 2020年10期

曾青红，周志辉，李梅芳，姚丹，罗露，曹敏

(湖南省妇幼保健院检验科，湖南长沙 410008)

人乳头瘤病毒(HPV)是一种小的球形环状双链DNA病毒，能特异性地引起人体皮肤黏膜的鳞状上皮增殖，可导致多种良、恶性病变，感染途径通常是性传播。有研究表明，女性不孕症可能与高危型HPV感染有关，国内一些研究报道了不同地区的不孕症女性HPV感染的情况[1-3]，已发现的HPV具有近200种亚型，但由于地理环境、人文面貌的不同，HPV感染的基因型别分布存在地域差异[4-6]。国内外已有报道不同地区的高危型HPV感染的基因分型，湖南地区也有针对普通人群的HPV筛查检测[7-8]，但是湖南地区并未开展针对不孕症女性HPV感染基因型别的研究。本研究采用北京博晖创新生物技术股份有限公司提供的试剂及仪器，检测湖南地区不孕症女性感染的HPV基因亚型，分析不孕症女性HPV感染情况与一般人群之间的差异，现报道如下。

1 资料与方法

1.1一般资料收集2017年1月至2019年7月在湖南省计划生育研究所生殖医学中心进行人类辅助生殖技术的不孕症女性1 664例(不孕组)、妇科门诊就诊的体检女性1 462例(对照组)的宫颈脱落细胞，人群均来自湖南省不同地区，年龄18～52岁。不孕症者定义为有1年未避孕性生活，仍未受孕或无活产者；对照组入选标准为月经规律，已婚已育且为自然受孕。

1.2仪器与试剂核酸芯片检测仪购自中国北京博晖创新生物技术股份有限公司，型号BHF-VI，检测方法采用PCR体外扩增和DNA反向斑点杂交法相结合的DNA芯片技术，检测24种HPV核酸亚型，包括高危型HPV亚型与低危型HPV亚型，分别为:HPV 6、11、16、18、31、33、35、39、42、43、44、45、51、52、53、56、58、59、66、68、73、81、82、83型。宫颈脱落细胞采集器购自中国北京博晖创新生物技术股份有限公司。

1.3方法

1.3.1标本采集所有女性均在月经来潮后10～18 d采集标本，采集前3 d不做阴道冲洗，不用避孕药膏等阴道内用药物，不进行醋酸或碘液涂抹，采集前24 h无性行为。先以窥阴器或阴道张开器暴露宫颈，用棉拭子将宫颈口过多的分泌物擦去，取出宫颈刷置于宫颈口，单方向旋转4～5周以获得足量的上皮细胞标本，然后将宫颈刷头部放入洗脱管中，沿刷柄折痕处将宫颈刷柄折断，旋紧洗脱管盖，做好标本标识，并保持洗脱管直立放置。标本采集后尽快送检，当天来不及上机检测的标本-20 ℃保存，避免反复冻融。

1.3.2标本检测充分洗脱宫颈刷，并在管壁上挤干。取1 mL洗脱液转移至1.5 mL离心管内，13 000 r/min离心10 min，弃去上清液，保留100 μL，使用移液器轻吸打3～5次，混匀待用。按照仪器说明书依次准备好仪器与试剂，手动加50 μL处理好的标本至微流控芯片加样孔。运行HPV检测试剂盒(生物芯片法)操作程序，依次进行核酸提取、PCR扩增、反向斑点杂交、扫描分析实验结果。

1.3.3结果判读杂交膜的显色质控探针与内参质控点都有阳性斑点，HPV探针出现阳性斑点，提示标本为该探针对应亚型阳性。杂交膜的显色质控探针与内参质控点都有阳性斑点，HPV探针无阳性斑点出现，提示标本为该探针对应亚型阴性。

1.4统计学处理采用Excel对数据进行统计分析，分别统计感染的亚型、不同年龄阶段及感染种类(单种和多重感染)，组间比较采用χ2检验，P<0.05表示差异有统计学意义。

2 结果

2.12组HPV亚型感染情况不孕组1 664例女性HPV总感染率为16.3%，对照组1 462例女性总感染率为15.5%，不孕组与对照组均是高危型HPV感染率最高。2组间的总感染率，低危型、高危型HPV感染率差异无统计学意义(P>0.05)。不孕组与对照组HPV多重感染率虽然差异有统计学意义(P<0.05)，但由于多重感染例数检出少，不足以支持结果。见表1。

表1 2组中HPV亚型感染情况

注:χ2、P为2组间感染率比较的统计值。

2.22组HPV亚型分布情况在不孕症女性中，18种HPV高危亚型均被检出，感染率最高的是HPV52型，其次为HPV18、51、16型，较低感染型别分别是HPV45、83、73型；6种HPV低危亚型中，HPV81型感染率最高；共检出多重感染19例，其中四重感染1例，三重感染1例，其余为双重感染。对照组高危HPV52型感染率最高，其次为HPV51、16、18型，较低感染型别分别是HPV35、83、73型。感染率较高的高危型HPV在不孕组与对照组中感染率比较，差异无统计学意义(P>0.05)。见表2。

表2 2组HPV亚型分布情况

续表2 2组HPV亚型分布情况

注:-表示该项无数据；χ2、P为2组间感染率比较的统计值。

2.3不同年龄阶段女性HPV感染情况不孕组31～40岁HPV感染率低于18～30岁(χ2=13.66，P=0.000)与41～52岁女性(χ2=10.98，P=0.001)；18～30岁与41～52岁HPV感染率差异无统计学意义(χ2=0.157，P=0.692)。对照组31～40岁HPV感染率同样低于18～30岁(χ2=15.54，P=0.000)与41～52岁女性(χ2=11.19，P=0.001)；18～30岁与41～52岁HPV感染率差异无统计学意义(χ2=0.225，P=0.635)。不孕组不同年龄段的HPV感染率与对照组比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表3。

表3 不同年龄阶段女性HPV感染情况

注:χ2、P为2组间HPV检出率比较的统计值。

3 讨论

多种因素可以引起不孕，泌尿生殖道感染是其中一个重要的因素，HPV可从生殖道逆行感染子宫、输卵管等附件，造成慢性宫颈炎、子宫内膜炎或输卵管形态和功能损害，导致育龄女性不孕[9-10]，但HPV感染是否为导致不孕症的独立因素，不同学者之间仍存在争议。张立冬等[11]对比广州市区不孕症女性与体检健康女性的HPV感染率，发现不孕症女性HPV感染率远高于体检健康女性，而本研究发现在湖南地区，不孕症女性与妇科门诊女性HPV高危型和低危型单一感染率差异并无统计学意义(P>0.05)，与伍金华等[12]发现广东江门地区不孕症女性HPV感染率与体检健康女性一致。另有一些研究表明，HPV多重感染会改变阴道内微环境，较单一感染，多重感染清除难度大、时间长，同时阴道正常环境的改变又容易使其他病毒、细菌、支原体、衣原体等协同感染，多重因素引起子宫、输卵管等慢性炎症，最终导致不孕[13-14]。本研究发现不孕组HPV多重感染率高于对照组，但由于多重感染例数检出少，不足以支持结果，较少文献报道HPV多重感染与不孕症之间的直接关系，故HPV多重感染是否是造成女性不孕的独立因素有待继续研究。

本研究发现，湖南省不孕症女性主要感染的类型为HPV52型，其次为HPV18、51、16型，不同于张立冬等[11]发现广州市区不孕症女性主要感染类型为HPV16、18、41、51型的报道，伍金华等[12]发现广东江门地区不孕症患者主要感染HPV52、58、16、66型及周潞等[1]发现四川地区非输卵管不孕主要感染HPV16、53、58型，输卵管不孕主要感染HPV58、52型的报道。这可能是由于HPV亚型分布存在地域差异。从年龄分析表明不孕组与对照组在不同年龄阶段HPV感染率并无明显差别，但不孕组和对照组在18～30岁和41～52岁的HPV感染率均高于31～40岁，且差异有统计学意义(P<0.05)，这可能是因为18～30岁人群性生活活跃，性伴侣数量为多个的概率较大，41～52岁人群自我保健意识不强，自身抵抗能力下降[15-16]。