滋养层细胞表面抗原2和DNA甲基转移酶1在鼻咽癌中的表达及与其临床病理特征的相关性分析

李志伟，缪 琴，王 为

鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma， NPC)是一种发生于鼻咽部的恶性肿瘤，是我国高发恶性肿瘤之一[1]。在NPC疾病初期，患者症状均较轻且常见，故未引起重视，多数患者就诊时已发展至疾病中晚期[2]。目前临床上常通过CT及核磁共振成像(MRI)等检查对NPC患者的病情分期及治疗进行有效评估。放疗是临床上针对NPC的首选治疗方法，可有效控制其病情，但仍有少数患者治疗后再复发甚至发生恶化转移，故对NPC发生及病变过程中患者体内相关生物分子表达情况进行研究于患者预后具有重要指导意义[3]。滋养层细胞表面抗原2(trophoblast cell surface antigen 2, Trop2)是一种存在于细胞表面的糖蛋白，对恶性肿瘤的迁移与侵袭具有调控作用[4]。而DNA甲基化在全身各类细胞发育过程中也具有积极作用，其中最为常见且发挥作用的就是DNA甲基转移酶1(DNA Methyltransferase 1, DNMT1)[5]。目前临床上对于Trop2与DNA甲基化对NPC病变过程的影响的研究较为少见[6]。本研究通过对本院确诊131例NPC患者的临床资料进行探究，分析Trop2、DNMT1的表达与该类患者临床病理特征的相关性。现报告如下。

1 资料与方法

1.1一般资料 回顾性分析我院2014年5月—2019年5月收治的131例NPC患者的临床资料，男96例，女35例；年龄22～64(42.38±7.26)岁。临床分期：Ⅰ～Ⅱ期45例，Ⅲ～Ⅳ期86例。 ①纳入标准：符合NPC诊断标准且经病理检查结果证实[7]；术前未行抗癌辅助治疗；患者对本研究知情,并签署同意书。 ②排除标准：伴严重系统性疾病；合并全身其他类型恶性肿瘤。本研究经医院医学伦理委员会审核通过，临床资料均完整。

1.2仪器与试剂 10%甲醛溶液、石蜡、Trazol溶液(日本Takara公司)、PCR仪(美国ABI-7500 Real-Time PCR)、通用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连接(SP)试剂盒、兔抗人Trop2多克隆抗体(英国Abcam公司)、羊抗人DAMT1多克隆抗体(英国Abcam公司)、经HRP标记的羊抗鼠及羊抗兔抗体(美国Earthox公司)。

1.3检测方法

1.3.1Trop2表达水平检测：取患者鼻咽部黏膜组织，在30 min内将黏膜组织置于10%甲醛溶液中固定浸泡，石蜡包埋切片、二甲苯脱蜡、梯度乙醇予以脱水，并使用枸橼酸盐修复液对组织进行3 min的高压修复，修复完成后用免疫组化笔在受检组织1～2 mm外划圈，再加入3% H2O2放置于恒温箱中孵育20 min，以阻断内源性过氧化物酶干扰，并运用磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗，漂洗3次后加入适量的10%正常羊血清于室温下密闭15 min，弃血清，并以1∶500的稀释比例滴加兔抗人Trop2多克隆抗体放置于4℃的恒温箱中过夜，再用PBS漂洗3次，并予以DAB显色、苏木素复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。各组标本均将PBS代替一抗作为阴性对照，以自身对照作为阳性对照。

1.3.2DNMT1表达水平检测：取患者鼻咽部黏膜组织，由相关专业人员用Trazol溶液将黏膜组织样本和总RNA进行提取，并严格按照试剂盒说明合成cRNA。设计DNMT1引物，DNMT1上游序列5'-GATGATTCCTCAAAACCGCTGTA-3'；下游序列5'-GTAGGTCTTCCCGTCGTCCC-3'。合成完毕后取所有患者的cDNA 5 μl，将其作为模板，再分别加入至2 μl 10×buffer和4 μl H2O中，并经过高温变性、循环，再进行PCR仪检测。将PCR产物经1.5%的琼脂糖凝胶电泳，参考DL 2000 marker分子质量标准进行紫外凝胶扫描成像，该样本的表达相对强度则为与样本内对照β-actin的荧光强度比值。所有操作均严格遵循说明书要求执行。

1.4Trop2及DNMT1蛋白免疫组织学结果判定标准 参照参考文献[8]进行判定：由两位病理科医生在400倍光镜下随机选取10个视野对染色细胞数量和染色程度进行评分。①阳性细胞数量：<1%为0分，1%～10%为1分，10%～50%为2分，>50%为3分。②染色程度：无染色为0分，弱阳性显黄色为1分，中等阳性显浅棕色为2分，强阳性显棕褐色为3分，并将二者所得分数合计，0～3分为无表达或低表达，4～6分为高表达。

2 结果

2.1NPC患者癌组织和癌旁组织的Trop2及DNMT1蛋白表达水平比较 NPC患者鼻咽组织Trop2、DNMT1阳性表达于细胞膜上，于其细胞膜处可见较多的棕色颗粒。见图1。NPC组织的Trop2、DNMT1蛋白表达水平显著高于癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.01)。见表1。

图1 NPC癌组织中DNMT1和Trop2蛋白表达(SP×100)

A. DNMT1蛋白表达；B. Trop2蛋白表达；NPC为鼻咽癌，DNMT1为DNA甲基转移酶1，Trop2为滋养层细胞表面抗原2

表1 Trop2及DNMT1蛋白在NPC癌组织和癌旁组织的表达水平比较[例(%)]

注：NPC为鼻咽癌，Trop2为滋养层细胞表面抗原2，DNMT1为DNA甲基转移酶1；与癌旁组织比较，bP<0.01

2.2NPC癌组织中Trop2、DNMT1蛋白表达与患者临床病理特征的关系 NPC癌组织中Trop2、DNMT1的蛋白表达水平与患者性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)。NPC患者TNM分期处于Ⅲ～Ⅳ期、伴淋巴结转移者Trop2、DNMT1的蛋白表达水平明显高于Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移者，差异有统计学意义(P<0.05)。见表2。

表2 NPC癌组织中Trop2、DNMT1蛋白表达水平与患者临床病理特征的关系[例(%)]

注：NPC为鼻咽癌，Trop2为滋养层细胞表面抗原2，DNMT1为DNA甲基转移酶1

2.3NPC患者Trop2、DNMT1蛋白表达与临床病理特征的相关性分析 经Spearman相关性分析，结果显示，NPC患者Trop2、DNMT1蛋白表达水平与TNM分期、淋巴结转移程度呈正相关(P<0.05)。见表3。

表3 NPC患者Trop2、DNMT1的表达与临床病理特征的相关性分析

注：NPC为鼻咽癌，Trop2为滋养层细胞表面抗原2，DNMT1为DNA甲基转移酶1

3 讨论

NPC是我国最常见的恶性肿瘤之一，具有高度的侵袭性和转移性，好发于南方各省，发病具有明显的种族、家族和地区聚集现象[9]。据相关数据显示，全世界80%的NPC发生在我国，多见于30～50岁的患者，男∶女为2～3∶1[10]。NPC患者常出现鼻塞、涕中带血、头晕头痛、听力下降、耳鸣以及复视等症状，且老年人和年轻人均有可能发生，对人们的健康造成了严重影响[11]。NPC早期患者5年生存率可达70%以上;若疾病恶化发展至晚期，5年生存率仅为8%～10%，故该疾病的发病机制及病理分期可影响患者后续治疗及生活质量[12]。

大多数学者均认为NPC的发病与EB病毒感染、吸烟、遗传及环境因素有关；然而近年来有相关学者研究发现，DNA甲基化及滋养层细胞表面抗原在NPC发病的过程中具有重要意义[13-14]。DNA甲基化对胚胎发育、细胞分化及基因调解具有重要作用，若DNA甲基化发生异常可导致正常基因功能中断并引发各类疾病[15-16]。不同形式的异常DNA甲基化常发生于恶性肿瘤患者机体中:发生某些基因和重复序列的高度甲基化、抑癌基因的高度甲基化及DNA甲基化转移酶(DNMTs)表达异常等[17]。DNMT是调节DNA甲基化的关键因子之一，临床研究发现，存在于人体中且具有活性的DNMTs仅有3个:DNMT1、DNMT3a、DNMT3b，且不同的DNMT在肿瘤组织中表达水平不均一[18]。有报道称DNMT1和DNMT3b在胃癌中呈高表达水平，在一定程度上诱导了DNA甲基化[19]。Trop2是一种在滋养层细胞中发现的跨膜糖蛋白[20]。有相关学者研究发现，Trop2在健康机体的表达较低，而广泛表达于大量肿瘤患者机体中，且与肿瘤的性质、TNM分期、分化程度、淋巴结转移程度等存在密切联系[21]。本研究中结果显示，Trop2、DNMT1蛋白在NPC癌组织中呈高表达状态，且明显高于癌旁组织；伴随有淋巴结转移及TNM分期处于Ⅲ～Ⅳ期的NPC患者的Trop2、DNMT1蛋白表达水平更高。这有效的验证了上述研究的说法，而在临床上，伴淋巴结转移NPC晚期患者预后较差，这也在一定程度上说明了，Trop2、DNMT1蛋白表达水平与该疾病的预后具有一定的相关性。本研究对NPC患者Trop2、DNMT1表达水平与病理特征的相关性进行分析发现，Trop2、DNMT1蛋白表达水平与TNM分期、淋巴结转移程度呈正相关，与陈顺金等[22]及刘宇轩[23]研究结果一致。

综上所述，NPC患者Trop2、DNMT1蛋白表达水平与其病理分期及淋巴结转移情况具有相关性。临床治疗上可根据Trop2、DNMT1蛋白表达情况对患者病情评估与治疗指导，可通过有效抑制DNMT1、Trop2的表达来抑制恶性肿瘤的发生。