凯里白酸汤发酵过程中挥发性风味物质的变化

王思婷，贾利蓉*，段飞霞，李大飞，张浩岩，田其明，钟定江

(1.四川大学 轻工科学与工程学院，成都 610065；2.麻江县明洋食品有限公司，贵州 凯里 556000)

白酸汤起源于贵州省苗族侗族自治州，是一种以米浆为主要原料，经乳酸发酵制成的调味品。贵州地区过去食盐匮乏，当地人创造出“以酸代盐”的调味方法，形成独特的酸汤文化。传统白酸汤的制作是将淘米水放在火塘边自然发酵，随用随取，再不断添加淘米水。现代白酸汤工业生产是以米浆为原料，大型土坛为容器，采用5 d为1个周期的控温发酵，每个周期结束时留存一部分酸汤作为发酵母液，形成循环发酵工艺[1]。白酸汤富含有机酸、矿物质、乳酸菌等，具有解暑、刺激食欲、助消化、调节肠道微生态平衡的作用[2]。

目前，关于白酸汤的研究主要集中在微生物筛选、营养研究等方面。陈大卫等[3]从酸汤中分离筛选乳酸菌，成功筛选出2株菌株。石敏等对发酵过程中主要微生物种群及营养成分进行了研究，发现主要菌群为乳杆菌、醋酸杆菌和酵母菌。对于白酸汤的挥发性成分，尤其是不同发酵阶段挥发性成分的变化研究，尚未见相关报道。白酸汤的工业生产目前尚处于起步阶段，其品质主要通过感官和总酸含量来评估。本文采用GC-MS对不同发酵阶段的白酸汤挥发性成分进行跟踪研究，旨在探究白酸汤发酵过程中挥发性风味成分变化规律，为提升产品质量和促进白酸汤工业化发展提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

凯里白酸汤取自贵州凯里麻江县明洋食品有限公司的酸汤生产基地，以无菌操作收集发酵1，2，3，4，5 d的样品，取样时先将白酸汤搅动均匀后静置2 h，将样品置于-20 ℃冰箱中待分析测定。

1.2 仪器与设备

GC-2010 Plus GC-MS联用仪、DB-5MS 弹性石英毛细管柱 (30 m×0.25 mm，0.25 μm) 日本岛津公司；SPME装置、50/30 μm DVB/CAR/PDMS萃取头 美国Supelco公司；15 mL顶空样品瓶；HH-ZK1单孔恒温水浴锅 上海一科仪器有限公司；FA 1004型电子天平 上海良平仪器仪表有限公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

先将纤维头在进样口于250 ℃老化10 min至无杂峰，取发酵1，2，3，4，5 d的白酸汤样品8 mL于20 mL顶空进样瓶中，加入2.5 g NaCl 密封。50 ℃下平衡20 min，将固相微萃取头(SPME)插入进样瓶中，纤维头不能直接接触液面。吸附40 min后收回纤维头，取出萃取头。将萃取头插入气相色谱-质谱仪(GC-MS)进样口，推出纤维头，于250 ℃解吸5 min。

1.3.2 SPME-GC/MS检测挥发性物质

挥发性物质的检测条件在 Lee Su-Won等[4]的方法基础上进行修改。

1.3.2.1 GC条件

DB-5MS色谱柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)，进样方式不分流，以氦气(纯度：99.999%)为载气，流速为1 mL/min。检测器温度250 ℃，程序升温：35 ℃保持8 min；以5 ℃/min升至150 ℃；以6 ℃/min升至210 ℃，保持1 min。

1.3.2.2 MS条件

接口温度250 ℃；离子源温度230 ℃，电离方式EI+，电子能量70 eV；扫描范围30～450 amu。

1.3.3 定性定量方法

将每种挥发性物质的质谱图与标准质谱库NIST 11 Library进行比对，选择相似度大于85的物质进行分析，并比对相关文献进行挥发性物质的定性。各挥发性成分的相对百分含量使用峰面积归一化计算。对定性确定的挥发性物质进行主成分分析，得到不同发酵阶段白酸汤风味上的差异。

1.4 数据处理

采用OriginPro 2016、SPSS软件进行数据的统计分析。

2 结果与分析

2.1 挥发性物质鉴定结果

用SPME-GC/MS对白酸汤不同发酵过程进行分析，得到的挥发性风味物质相对含量及种类见表1。

表1 不同发酵阶段的白酸汤中挥发性成分种类及相对含量Table 1 The types and relative content of volatile compounds in RSS at different fermentation stages

续 表

注：“—”表示未检出。

由表1可知，白酸汤在各个发酵阶段共检测到40种化合物，主要为酸、醇、酯、醛、酮、酚和萜烯等。其中，白酸汤发酵1 d检测出26种化合物，发酵2 d检测出27种，发酵3 d检测出32种，发酵4 d检测出33种，发酵5 d检测出30种化合物。5组样品中相对含量较高的物质主要有乙酸、丙酸、乳酸、乙醇、正丙醇、乙酸丙酯、丙酸丙酯和乳酸异丙酯、α-松油醇、(-)-4-萜品醇、芳樟醇等。不同的发酵阶段共同含有的物质有18种，风味物质的种类差异不明显，这可能与白酸汤独特的循环发酵方式有关，每轮发酵后以3/4上清液为成品，1/4沉淀物为下一轮发酵的起子。总体而言，在整个发酵过程中，发酵过程中，酸类、醇类、酯类、醛类的种类数量和相对含量随发酵进行缓慢增加；酚类物质和萜烯类的相对含量先增加后降低，萜烯类种类数量则先增加后减少。发酵3 d和4 d的白酸汤中风味物质最为丰富，分别有32种物质(相对含量为99.071%)和33种物质(相对含量为99.002%)。

2.2 发酵过程中各类挥发性物质的变化

白酸汤的发酵主要包括三个阶段，第一阶段是淀粉糖化；第二阶段是酒精发酵，主要通过酵母菌将可发酵糖转化为醇类物质；第三阶段是乙酸发酵，它是由醋酸菌将醇类物质氧化为酸类物质的过程[5]。发酵食品的香气成分主要来源于原料和发酵过程中产生的挥发性物质。与泡菜、红曲糯米酒及米醋等发酵食品相比，白酸汤的风味物质较少[6]，原因可能是原料只有糯米比较单一且发酵时间较短。

发酵过程中各类挥发性风味物质的种类数量和相对含量的变化情况见表2。对比可知，发酵前后白酸汤中挥发性风味物质种类和含量存在显著差异。在检测到的挥发性风味物质中醇类物质种类最多、含量最高，其次是酸类、酯类和萜烯类物质。这4种物质在挥发性物质中占主导地位，其含量占总挥发性化合物的98%以上。

表2 白酸汤发酵过程中挥发性风味物质种类及相对含量Table 2 The types and relative content of volatile flavor compounds in RSS during fermentation process

2.2.1 醇类物质

醇类物质主要来自于淀粉糖化后的酒精发酵阶段，发酵中期各类微生物生长繁殖较快，产生大量醇类物质，共同作用促进香气的形成，并且为有机酸提供前体物质。在整个发酵过程中，共鉴定出13种醇类，占总挥发性物质的61%以上。发酵1 d的白酸汤样品有醇类9种，发酵到第3天时为10种。相对含量从第1天的60.455%开始增加，到第3天时略有下降，随后继续增加。醇类物质的产生主要是乳酸菌、酵母菌等微生物利用糖类代谢产生，同时醇类可与酸类物质生成酯类，可能是第3天相对含量有所下降的原因。其中，正丙醇在所有醇类中的比例最高，其次是乙醇、葑醇和2-茨醇，这些物质赋予白酸汤独特的香气。其中正丙醇是在酒精发酵过程中形成的一种高级醇，具有水果、清洁和新鲜草木的风味[7]，是中国白酒、啤酒及葡萄酒中的重要风味物质。其相对含量从发酵第1天的54.314%逐渐上升至第5天的55.835%。乙醇能够赋予白酸汤清香味，相对含量从发酵第1天的4.411%逐渐增加，随后在第4天下降至4.076%。这些醇类物质还能与酸类物质发生酯化反应为白酸汤的香气做出一定贡献。

2.2.2 酸类物质

酸类物质是白酸汤中第二大类风味物质，共检测出9种酸，占总挥发性风味物质的13%左右，对白酸汤的呈味和呈香都起着重要作用。由表2可知发酵1 d的白酸汤含6种酸类，随发酵时间增加，在发酵3 d时达到最多为，8种，整体呈正态分布，这可能与微生物生长的趋势有关。在发酵第3天时，产酸较多，之后随着生长所需营养物质被大量消耗，导致生长速率受到抑制，产酸开始降低。在检测出的酸类物质中，乙酸含量最高，其次为乳酸、异戊酸。乙酸的相对含量随发酵时间逐渐增加，第5天时最高，为13.276%。同时乙酸的挥发性较强，对白酸汤酸味贡献很大。乳酸相对含量呈先增加后减少的趋势，发酵3 d时最高，为2.167%。乳酸可以赋予白酸汤清淡的香味，同时还能在酶的催化作用下与醇类结合形成乳酸异丙酯，进一步丰富白酸汤的风味。丁酸、正戊酸仅在发酵第3天检测到，说明第3天时白酸汤风味物质种类和数量最为丰富的时期。其中正戊酸为酸臭味，可能是白酸汤酸馊味的来源。乳酸菌利用五碳糖、六碳糖，通过糖代谢等途径产生乳酸、乙酸、异戊酸等有机酸[8]。酸类除了本身可以呈味，还能与醇类反应生成酯类，构成白酸汤独特的酸香风味，同时也赋予白酸汤营养保健功能，如调节肠道微生态平衡。成熟白酸的汤pH为3.03～3.35，这样的酸度环境能保留大多数感官气味和挥发性化合物，抑制病原菌，如大肠杆菌、枯草芽孢杆菌等。

2.2.3 酯类物质

酯类是白酸汤中种类和相对含量第三丰富的物质，酯类相对含量从1 d的14.784%逐渐增加至3 d的15.517%。在整个发酵过程中共鉴定出4种酯类，占总体的14%左右。其中乳酸异丙酯是最丰富的酯，其次是乙酸丙酯和丙酸丙酯。酯类来自醇类的酯化反应，酯类物质多具有水果般香气，且具有高挥发性和低阈值的特点，是发酵食品中最重要的挥发性气味成分之一[9]。从感官特性上看，乙酸丙酯有强烈的果香和酒香，并有猕猴桃、菠萝、香蕉香气。主要用于制造食用香料，并且在中国醋的香气成分中也有检测到[10]。

2.2.4 其他物质

醛类具有阈值低、赋予香气能力强等特点，在白酸汤中只有4种，且含量较低。其中壬醛呈苦杏仁味，发霉味，可能会对整体风味有不良影响。癸醛表现为甜橙和橘子香气、青香和脂肪香[11]。苯乙醛具有独特的香味，具有玫瑰香、桂花香、紫罗兰香和茉莉花香等多样的风味，对酱油风味也有较大贡献[12]，这些醛类物质在白酸汤的风味特征中起重要作用。甲基庚烯酮具有新鲜的青香、柑橘样香气。萜烯类物质在白酸汤发酵过程中属于第四大类。发酵第3天时，α-松油醇和(-)-4-萜品醇含量最丰富，分别达到7.052%和2.730%。橙花醇具有令人愉悦的玫瑰香气，异戊醇具有苹果白兰地香气和辛辣味。(-)-4-萜品醇具有胡椒香气，含量先增加后减少，可能与发酵过程中微生物生长有关。α-松油醇具有紫丁香花样香气，是茶的主要风味成分之一[13]。芳樟醇具有酸味、花香、新鲜的风味，也是泡菜中占比较大的物质[14]。右旋萜二烯有似鲜花的清淡香气[15]，含量较低，但香气阈值极低(41 μg/kg)，故对白酸汤风味有一定补充作用。2-壬酮、环已酮等酮类物质以及1,4-桉叶素和右旋萜二烯等都在发酵中后期被检测到，表明风味物质的形成更多在发酵后期。

2.3 挥发性风味物质的主成分分析

将白酸汤发酵过程中检测到的各种风味物质作为自变量，对其进行主成分分析，得出主成分的相关矩阵特征值、方差贡献率以及累计贡献率。

表3 主成分特征值、方差贡献率及累计贡献率Table 3 Eigenvalues, contribution rates and cumulative contribution rates of principal components

以主成分特征根大于1和累计方差贡献率大于85%为筛选标准，由表3可知，前3个主成分的贡献率分别为41.441%、27.774%、19.267%，累计达到88.482%，即涵盖了大部分信息，表明前3个主成分能够比较客观反映白酸汤发酵过程中挥发性物质的变化规律。

表4 主成分载荷矩阵Table 4 Loading matrix of principal components

续 表

白酸汤中各挥发性风味物质对主成分的影响大小体现在各主成分的载荷系数，因子负荷矩阵负荷越大，表明主成分对该变量的代表性越强[16]。由表4可知，第一主成分与丁酸、乳酸、戊酸、2-乙基己醇、正辛醇、芳樟醇、葑醇、α-松油醇、(-)-4-萜品醇、2-壬醇、橙花醇、2,3-丁二醇、丙酸丙酯等有比较强的相关性，对第二主成分贡献较大的物质有异丁酸、异戊酸、2-甲基丁酸、己酸、乙烯二乙酯、苯乙醛、甲基庚烯酮。对第三主成分贡献较大的物质有乙醇、乙酸丙酯。因主成分1，2，3贡献了85%以上的总方差，可认为以上22种物质为白酸汤发酵过程中主要的风味物质。将数据进行标准化处理，得出各样品的主成分值，进一步计算出综合得分，结果见表5。

表5 主成分综合得分Table 5 The comprehensive scores of principal components

综合得分反映了白酸汤的嗅闻强度，得分越高表明此时样品中所含有的风味物质和整个发酵过程中的香味物质越接近，此时的白酸汤风味最佳。由表5可知，随着白酸汤发酵的进行，综合得分从第1天的-2.49逐渐上升至最高，第3天的2.55。对整个发酵过程进行综合评价表明，发酵第3天的白酸汤风味最佳。主要与白酸汤中微生物的生长规律有关，发酵前期微生物主要进行生长繁殖，到发酵后期微生物的数量和种类增多后，产生的主要风味物质醇类、酸类和酯类的种类和含量也较多，因此发酵第3天的白酸汤样品综合得分最高。

3 结论

本文利用顶空固相微萃取-气相色谱质谱技术测定白酸汤发酵过程中的挥发性风味物质含量及种类变化规律，共检测到40种挥发性风味物质，酸类9种、醇类13种、酯类4种、醛类4种、酮类3种、酚类1种和萜烯类6种。其中醇类、酯类、酸类和萜烯类物质是最主要的风味物质，其含量占总挥发性风味物质的98%以上。发酵过程中风味物质的种类没有显著变化，在1～5 d的发酵过程中分别检测到26，27，32，33，30种，相同的物质有19种，可能与采用循环发酵工艺有关。在整个发酵过程中，酸类、醇类、酯类和醛类的种类数量和相对含量随发酵进行缓慢增加；酯类、酚类物质和萜烯类的相对含量先增加后降低，萜烯类的种类数量则先增加后减少。

通过SPSS软件对所有挥发性物质进行主成分分析，得到了22种主要的挥发性风味物质，发酵3 d的白酸汤综合得分最高。所有风味物质中，乙醇、葑醇、2-乙基己醇、正辛醇、2-壬醇等醇类物质，萜烯类物质中的芳樟醇、α-松油醇、和(-)-4-萜品醇、橙花醇，酸类物质中的乳酸、乙酸、丁酸、戊酸，酯类中的丙酸丙酯、乙酸丙酯等是对白酸汤风味贡献较大的物质。乳酸菌，醋酸菌等微生物利用淀粉生成乳酸、丙酸、乙酸以及酯类、醇类、醛类、酮类等，这些物质共同形成白酸汤的酸香味。白酸汤的风味与原料、发酵方法、微生物种类及多样性息息相关，本次实验研究了白酸汤发酵过程中的挥发性物质变化规律和特点，所得到的数据和结论对科学评估白酸汤的产品品质、促进白酸汤工业发展具有重大意义。