骨髓单个核细胞移植对溃疡性结肠炎小鼠miR-21及炎症因子TNF-α表达的影响

陈曦 韩宇鹏 陈刚 苗秋实 李锦伦 姜威

(佳木斯大学附属第一医院消化内科，黑龙江 佳木斯 154000)

溃疡性结肠炎(UC)属于炎症性肠病的范畴，近年来其发病率与患病率逐年增加。目前针对UC的传统治疗均未达到明确疗效，疾病控制并不理想，所以探索一种高效的治疗方法成为当前主要研究方向。研究发现〔1〕，骨髓单个核细胞(BM-MNCs)移植可以有效地治疗UC，但机制研究不多，本实验通过建立UC小鼠模型，使用BM-MNCs移植治疗小鼠UC，以探讨其作用机制。

1 材料和方法

1.1实验动物 54只健康成年KM小鼠，雄性，体重29～31 g，由辽宁长生生物技术股份有限公司提供。

1.2试剂 小鼠骨髓淋巴细胞分离液试剂盒(天津市灏洋生物制品科技有限责任公司)，磷酸盐缓冲液(PBS)(武汉博士德生物工程有限公司)，动物组织miRNA提取试剂盒(成都福际生物技术有限公司)、cDNA第一链合成试剂盒(上海罗氏)、葡聚糖硫酸钠(DSS)(美国MP公司)、电化学发光(ECL)液、放射免疫沉淀(RIPA)蛋白裂解液、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(碧云天生物技术公司)。

1.3分组与造模 将小鼠随机分成移植组、PBS组和Control组，每组18只。将移植组、PBS组进行UC模型造模，给予小鼠2.5%的DSS溶液自由饮用7 d，Control组常规实验中心灭菌水和饲料喂养。

1.4BM-MNCs制备 用10%的水合氯醛将KM小鼠麻醉处死，剥离股骨和胫骨，用剪刀剪断骨头两端，露出内腔，制备BM-MNCs悬液，实验操作严格按照说明书进行。台盼蓝检测骨髓细胞成活率，使用4′6-二脒基2-苯基吲哚(DAPI)标记BM-MNCs悬液。

1.5BM-MNCs移植 UC造模成功后，移植组经尾静脉注入0.4 ml细胞悬液(含3×106个DAPI标记的P3-BM-MNCs)；PBS组及Control组尾静脉注入0.4 ml PBS。

1.6一般情况观察 给予充足的水和食物，对小鼠的体质改变，进食、排便情况、体重及精神状态进行密切观察。小鼠疾病活动指数(DAI)评估〔2〕：实时观察检测体重变化、粪便性质，检测便隐血情况，并详细记录。根据表1进行DAI评分。

表1 DAI评分

1.7Western印迹检测结肠组织肿瘤坏死因子(TNF)-α的表达 移植5 d后，KM小鼠用10%水合氯醛麻醉处死，剖取结肠，纵行剪开，PBS冲洗后采集新鲜结肠组织，使用含苯甲基磺酰氟(PMSF)的RIPA裂解液制备蛋白样品，BCA试剂盒检测蛋白浓度，上样，60 V电泳30 min，80 V电泳90 min，恒流200 mA转模100 min，5%脱脂牛奶室温封闭1 h，一抗(1∶4 000)4℃过夜，Tween-20-Tris PBS(PBST)洗3次，每次10 min，二抗(1∶4 000)室温孵育1 h，PBST洗2遍，PBS洗1遍，加入ECL发光液进行曝光显影。

1.8实时聚合酶链反应(PCR)检测结肠组织miR-21的表达 采集新鲜的结肠组织30 mg，按照动物组织miRNA提取试剂盒说明书中的步骤，将小鼠结肠组织经液氮冰冻后磨碎匀浆，从中提取出总RNA。使用罗氏cDNA第一链合成试剂盒合成20 μl体系，其中包括模板-引物混合物13 μl、5×逆转录缓冲液4 μl、RNA水解酶抑制剂0.5 μl、脱氧核苷酸混合物(dNTP)2 μl、逆转录酶0.5 μl。反应条件为25℃下10 min，55℃条件下孵育30 min，加热至85℃维持5 min，将反应管置于冰上终止反应，得到cDNA。

实时PCR检测miR-21的表达，应用荧光定量PCR试剂盒合成50 μl体系，其中包括含cDNA模板5 μl、含20 mmol/L MgCl2的反应缓冲液(10×)5 μl、PCR核苷酸混合物1 μl、上游引物1 μl、下游引物1 μl。引物序列，miR-21a-5p上游：5′-CGCGCGTAGCTTATCAGACTGA-3′、下游：5′-ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG-3′；U6 上游：5′-CTCGCTCGGCAGCACA-3′、下游：5′-AACGCTCACGAATTGCGT-3′。DNA聚合酶0.4 μl、水 36.6 μl。U6为内参，反应条件为94℃预变性5 min，然后94℃ 10 s、50℃ 20 s、72℃ 30 s，35个循环，72℃ 7 min、4℃冷却。采用2-ΔΔCT表示miR-21的相对水平。

1.9统计学方法 采用SPSS21.0软件进行正态分布计量数据单因素方差及LSD法检验。

2 结 果

2.1各组DAI评分比较 移植组、PBS组、Control组DAI评分分别为(3.83±0.92)、(8.18±1.29)、0分，3组差异具有统计学意义(F=112.124，P=0.000 0)。与Control组相比，PBS组、移植组DAI评分明显升高(均P=0.000 0)。移植组DPI评分较PBS组明显降低(P=0.000 0)。

2.2各组组织中miR-21、TNF-α水平 Control组、PBS组和移植组miR-21、TNF-α水平差异有统计学意义(P=0.000 0)。PBS组miR-21、TNF-α表达显著高于Control组(P=0.000 0)，且移植组miR-21、TNF-α表达显著低于PBS组(P=0.000 2)。见表2、图1。

表2 3组组织miR-21、TNF-α相对表达量

与Control组相比:1)P<0.001;与PBS相比:2)P<0.001

图1 3组结肠组织中TNF-α的表达

3 讨 论

BM-MNCs是骨髓中一种具有多种潜能的成体干细胞，其中包括造血干细胞，骨髓间充质干细胞和内皮祖细胞〔3〕。BM-MNCs具有向多种细胞分化的能力，如内胚层、中胚层及神经外胚层来源细胞，还可以在适当的条件下分化为软骨、骨骼肌细胞、心肌细胞、脂肪、神经细胞等〔4〕。BM-MNCs还可以通过细胞间的相互作用产生细胞因子，从而调节免疫反应〔5〕。研究证明，BM-MNCs可以通过血液循环定植于肠道组织中，被标记的BM-MNCs成功移植到UC小鼠模型后，可以分布在肠道黏膜层，并通过调节肠道免疫、修复肠道黏膜、改善胃肠动力等方式来治疗UC〔6,7〕。

UC是一种发生在肠道的慢性非特异性炎性疾病，病程长，常在加重与缓解中反复发作、迁延不愈，病情较凶险，严重时可威胁患者的生命〔8〕。UC的发病机制至今仍未明确，目前普遍认为与遗传、环境、免疫、肠道菌群有关〔9〕，特别是免疫越来越受到大家的重视，主要表现为促炎因子与抑炎因子的调节失衡。多项研究证明，炎症因子与UC发病关系密切〔10〕。TNF-α是一种重要的促炎症细胞因子，它主要由单核巨噬细胞、T细胞和B细胞分泌，TNF-α可以激活上皮细胞，诱导趋化因子，聚集中性粒细胞，放大炎症效应，导致肠黏膜组织损伤。大量实验证明，TNF-α的表达水平与UC严重程度呈正相关〔11〕。微小RNA(miRNA)是一类有19～24个核苷酸组成的短小非编码RNA，可以通过其表达水平的上调或下调，在转录后抑制或降解不同靶 mRNA 的表达继而引起下游相应靶点基因的改变，从而影响组织和细胞的功能。miR-21是哺乳动物的众多细胞类型中表达水平最高的非编码RNA，既往关于miR-21的研究多集中在肿瘤方向，miR-21可以下调抑癌基因的表达从而具有促癌作用。近年来，Svrcek等〔12〕发现miR-21在炎症性肠病(IBD)患者肠黏膜组织中呈高表达，并且通过抑制巨噬细胞甘露糖受体发挥作用。研究表明，在UC中，miR-21上调可以导致Rho-mRNA降解从而使肠上皮通透性增加，损坏肠黏膜屏障，加重炎症反应，参与UC的发病过程〔13,14〕。miR-21与UC的炎症反应呈正相关，并可以作为评估UC炎症反应程度的重要指标。

本研究提示BM-MNCs移植治疗可以改善小鼠的一般状态、减轻肠道炎症反应，对UC起到一定的治疗作用。TNF-α、miR-21的表达水平与UC的发生发展具有相关性。BM-MNCs移植治疗能通过降低TNF-α、miR-21的表达水平而发挥治疗作用。