新疆维吾尔族认知功能障碍与IMT、HCY和MTHFR基因C677T多态性的相关性

张雷 卡比努尔·克依木 周晓辉

(新疆医科大学第一附属医院，新疆 乌鲁木齐 830000)

动脉粥样硬化是引起血管性痴呆和阿尔茨海默病(AD)的因素之一〔1，2〕。研究表明，除其他血管危险因素外，血浆同型半胱氨酸(HCY)水平升高与AD易感性显著相关〔3〕。此外，在非痴呆老年人群中，HCY血浆水平与总体认知能力和特定认知技能呈负相关〔4〕。

HCY来源于S-腺苷甲硫氨酸的去甲基化，此过程包括两个循环，其中一个循环是HCY和甲硫氨酸之间转换的代谢过程，其限速酶是亚甲基四氢叶酸还原酶(MTHFR)和甜菜碱HCY甲基转移酶。HCY可以通过胱硫醚β合酶代谢合成HCY。MTHFR需要叶酸和维生素B12，而胱硫醚β合酶需要维生素B6作为辅助因子〔5〕。HCY血浆水平在普通人群中差异很大，可能受多种因素影响，包括叶酸和维生素B12〔6〕。血浆HCY也可能受到MTHFR基因多态性的影响，其特征是碱基在677位点上由C替换为T。35%的高加索人群中出现了T677等位基因，其中包括高达10%～20%的TT纯合子。MTHFR基因TT677基因型的携带者经常表现出血浆HCY水平的升高，因此，TT677基因型携带者被认为患血管疾病和AD的风险更高〔6〕。英国的一项研究结果显示健康受试者血浆HCY与颈动脉内膜中层厚度(IMT)呈正相关，而TT677 MTHFR基因型没有任何影响〔7〕。研究还表明IMT增加与AD患病风险相关，提示动脉壁增厚可能是脑血管功能障碍的标志〔1〕。最近的研究结果展示了颈动脉粥样硬化的进展，即IMT增加与认知能力下降之间的联系〔2〕。目前高同型半胱氨酸血症(HHcy)在动脉粥样硬化和AD中的作用机制尚不完全清楚。

本研究旨在研究认知功能减退〔AD或失忆性轻度认知障碍(MCI)〕患者HCY血浆水平是否与IMT值相关及HHCY的遗传风险因素对动脉粥样硬化过程和认知能力下降的可能影响。

1 对象和方法

1.1研究对象 根据纳入和排除选择标准招募新疆维吾尔族63例认知障碍患者(45例AD患者，18例MCI患者)进行本研究，根据美国神经病学、语言障碍及脑卒中-AD和相关疾病学会(NINCDS-ADRDA)标准诊断AD，MCI根据美国精神病学会的精神障碍诊断和统计手册的第四次修订版(DSM-Ⅳ)诊断〔8，9〕。最终64例认知障碍患者(病例组)参加了这项研究，他们在神经疾病方面无临床症状，且年龄和性别符合要求。选取年龄及性别匹配的健康体检者为对照组研究对象，并进行认知缺陷筛查。患者均由两位神经内科医师做出诊断。病例组和对照组的筛查标准为：(1)主要血管疾病(即脑卒中、冠状动脉缺血性疾病、静脉血栓形成);(2)慢性酒精摄入或吸烟；(3)使用药物增加血浆HCY(即苯妥英钠、左旋多巴、甲氨蝶呤)；(4)维生素补充剂摄入量。受试者均接受神经心理评估、颈部血管彩色双联检查、生化分析、MTHFR C677T基因分型。研究方案得到了当地伦理委员会的批准。从护理者和非护理参与者处获得签署的知情同意书。

1.2神经心理评估 研究对象进行简易精神状态量表(MMSE)、日常活动量表(ADL)、临床痴呆评定量表(CDR)的评定及精神退化电流的测试。

1.3IMT评估 受试者接受了颈动脉彩色多普勒超声检查。IMT在离分流器近1.5 cm处的颈总动脉(CCA)上进行评估。IMT为颈总动脉后壁表现为相对较低回声分割平行线间距离。

1.4生化指标测量 每天早晨采集空腹血标本，按HCY测定标准程序分离血浆，并连同血清样本一起立即在-80℃冷冻。血浆HCY采用高效液相色谱-荧光法测定。以DL-HCY为外标，N-乙酰半胱氨酸为内标，用放射免疫法测定血浆叶酸和维生素B12(美国Beckman公司)。使用试剂盒(Horiba ABX，MontPellier，France)对总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、三酰甘油、肌酐和促甲状腺激素(TSH)水平进行检测。

1.5MT6FR C677T基因分型

1.5.1MTHFR基因PCR扩增及纯化 PCR引物：C677T上游引物序列：5′-GCCTCAAAGAAAAGCTGCGTGAT-3′；C677T下游引物序列：5′-CCCAGTCCCTGTGGTCTCTTCA-3′。PCR扩增：PCR总反应体系为20 μl，包含1×GC缓冲液，3.0 mmol Mg2+，0.3 mmol脱氧核糖核苷三磷酸(dNTP)，1 U高保真Taq聚合酶(Qiagen，北京)，1 μl样本DNA和2 μl多重PCR引物。PCR循环程序：95℃预变性2 min； 94℃ 20 s、60℃循环40 s、72℃ 90 s，共11个循环；94℃ 20 s，59℃ 30 s，72℃ 90 s，共24个循环；72℃延伸2 min；4℃恒温。

1.5.2多重碱基延伸SNP分型技术(SNaPshot) C677T延伸引物：5′-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-TTTTGCTGCGTGATGATGAAATYG-3′。延伸反应体系(10 μl)包括5 μl SNaPshot多重反应试剂盒(ABI)，2 μl纯化后多重PCR产物，1 μl延伸引物混合物，2 μl超纯水。

1.6统计分析 采用Statistica6.0进行t检验、χ2检验、协方差分析(ANCOVA)。在ANCOVA分析中，通过shaPiro-wilks检验得出残差服从正态分布。通过单因素方差分析评价患者和对照组血浆HCY和IMT的差异(根据MTHFR基因型或临床诊断分组)。采用Bonferroni校正法对各ANCOVA和单向方差分析进行事后分析。通过Pearson积矩系数的计算，对患者及对照组进行了生化参数、年龄、IMT和MMSE的相关分析。线性回归分析，根据常规血管危险因素、TT677MTHFR和血浆HCY的存在与否对IMT进行回归。随后，这些假定的预测因子和IMT被纳入另一个以MMSE为因变量的回归设计中。为了评估IMT是否是与认知能力下降相关的中间因素，采用渐进分布自由Gramian程序进行了结构方程建模(SEM)，将传统的血管危险因素和TT677MTHFR作为外生变量，并将HCY血浆水平、IMT和MMSE作为内生变量。

2 结 果

2.1两组基线资料比较 两组年龄、性别、血脂异常、高血压、糖尿病、三酰甘油、LDL-C、总胆固醇、维生素B12、肌酐和TSH水平等方面比较差异无统计学意义(P>0.05)。病例组MMSE评分、叶酸水平显著低于对照组(P<0.05)，IMT和HCY浓度显著高于对照组(P<0.05)。见表1。

2.2MTHFR基因C677T位点基因型和等位基因频率分布 两组MTHFR基因C677T位点TT基因型和T等位基因分布差异显著(P<0.05)。采用χ2检验分别计算C677T位点基因型频率在两组间的分布，结果均符合Hardy-Weinberg遗传平衡定律，吻合度检验良好。见表2。

2.3两组HCY、IMT与MMSE评分的相关性 控制年龄的情况下，IMT值和血浆HCY均与MMSE评分呈显著负相关(r=-0.74，P<0.001;r=-0.70，P<0.001)。见图1。

表1 两组一般资料比较

表2 两组MTHFR基因C677T位点基因型和等位基因频率分布比较〔n(%)〕

图1 年龄调整后HCY、IMT与MMSE评分的相关性

2.4MTHFR基因C677T位点不同基因型血浆HCY和IMT水平 校正年龄和血浆叶酸后，单因素方差分析显示，两组血浆HCY和IMT差异显著(P<0.05)。病例组MTHFR TT677基因型血浆HCY和IMT含量显著最高。见表3。

表3 MTHFR不同基因型血浆HCY和IMT水平

与对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01

2.5认知障碍患者的IMT、高血压、MTHFR TT677基因型、HCY与MMSE评分、IMT的关系 在认知障碍患者中，简单线性回归显示IMT和MMSE评分与血浆HCY(均β=0.58、0.72；均P<0.001)、TT677MTHFR基因型(β=0.49、0.58，均P<0.001)和高血压(β=0.35、P<0.001，β=0.28、P=0.030)显著相关。这些变量包括在多元回归模型中，该模型证实了血浆HCY、TT677MTHFR基因型和高血压与IMT之间存在显著相关性。多重回归显示，血浆HCY和TT677 MTHFR基因型对MMSE评分有显著影响，而高血压则显示出临界相关性。在该回归模型中加入IMT后，其他预测变量的部分回归系数也随之减少，提示其可能是一种中间因子。见表4。

表4 多元回归分析认知障碍患者的IMT、高血压、MTHFR TT677基因型、HCY与MMSE评分、IMT的关系

1)线性回归系数R2=0.63，调整后的拟合系数 =0.38。2)线性回归系数R2=0.75，调整后的拟合系数=0.54

2.6线性方程模型分析IMT、高血压、MTHFR TT677基因型、HCY与MMSE评分的相关性 IMT对认知的影响与所有预测因子的预测值有关。此外，对拟合优度的检查显示，观察到的相关矩阵与预期的相关矩阵之间没有显著差异(χ2=0.85，df=2，P=0.650；RMS标准化残差=0.02)。由于在简单回归分析中，血脂异常和糖尿病与IMT(分别为β=0.03、P=0.784和β=0.10、P=0.342)和MMSE评分(分别为β=0.01、P=0.764和β=-0.08、P=0.457)无显著相关性，因此它们不包括在两个多重回归模型中，也不包括在线性方程模型分析中。

3 讨 论

本研究的主要发现是HHCY与认知功能障碍严重程度和IMT有关。与非携带者相比，携带MTHFR TT677基因型的患者的这种相关性更强。HHCY是心脑血管疾病的一个众所周知的危险因素〔10，11〕。尽管有一些有争议的研究结果，但大量的横断面研究表明，血浆HCY升高也是认知障碍〔12〕和AD〔3〕的危险因素。

实验数据还证实了认知障碍与HHcy之间的关系。HHCY的小鼠在Morris水迷宫测试中显示出显著的认知障碍，同时微血管中β淀粉样蛋白(Aβ)转运蛋白含量显著升高，而Aβ对认知有极大损害作用〔5，13〕。在伴有Willis多边形动脉粥样硬化的AD患者中观察到与缺血性病变无关的神经炎斑块的面积增加〔14〕。这些发现与神经放射学研究一致，证明了存在轻微脑血管损伤的情况下，血浆HCY与整个大脑和颞部萎缩之间的关系，而不仅仅是神经元数量的丢失〔15，16〕。此外，在冠心病患者中，高水平的HCY与脑N-乙酰-天冬氨酸(一种神经损伤的特殊标志物)浓度的降低有关，这表明HCY具有直接的神经毒性作用〔17〕。

本研究还表明，即使在控制了年龄，其他心血管危险因素和肌酐、叶酸、维生素B12水平等潜在混杂因素后，TT677 MTHFR基因型也可通过增加血浆HCY对IMT发挥作用。新疆维吾尔族T677 MTHFR等位基因的频率低于其他民族和国家的人群〔18〕。在魏亮妹等〔19〕筛选的病例中，有33.8%的人群携带 MTHFR基因TT677基因型。本研究在31.7%的患者中确定了MTHFR TT677基因型，与Passaro等〔20，21〕的结果一致：意大利老年妇女IMT与TT677 MTHFR基因型相关的增加，并且Meta分析也同样证明了具有此基因型的受试者IMT增加。

本研究观察到高血压与MMSE评分之间存在显著的相关性，但与IMT升高无直接相关性。横断面研究显示，高血压与认知障碍之间的关系有着相互矛盾的结果〔22〕。本研究显示，对患者简单线性回归分析后，高血压与MMSE有轻微的相关性。当将高血压与IMT、血浆HCY和TT677 MTHFR基因型一起纳入多元回归分析时，这种效应消失。这一发现可以解释为高血压对动脉粥样硬化介导的MMSE的间接影响。线性方程模型分析进一步支持这一假设，证明了高血压，内膜中层增厚程度和认知障碍严重程度之间的关系。IMT增加可能是动脉粥样硬化的标志，也可能是脑微循环的标志。脑循环微环境的改变可能导致弥漫性低灌注和慢性缺氧，最终引发神经退行性改变〔23〕。

在本研究中，血浆HCY和MMSE评分之间的关系由两个偶然的联系来解释：(1)血浆HCY直接影响认知状态；(2)HCY水平对MMSE的影响部分由IMT增加对认知能力的影响介导。本研究表明，MTHFR基因TT677基因型可以作为鉴定AD患者的一个因素。HHCY具有直接的神经毒性，并可能导致亚临床微血管损伤，可能与神经退行性过程在认知功能下降的发展中相互作用。

本研究主要局限性是筛选队列的小样本量，尽管统计功率分析显示筛选出的研究设计病例数量符合要求。此外，作为一项病例对照研究，无法评估HCY水平、IMT和MMSE之间的时间关系。

综上MTHFR基因TT677基因型促进血浆HCY的增加，这反过来可能有利于认知障碍患者内膜增厚。HCY可能通过多种机制促进神经元损伤，包括IMT增加介导的微血管损伤和直接的神经毒性作用。