Box-Behnken中心组合设计研发新型开菲尔乳酒

文星科，王琪，2，刘琨毅，3，*

（1.宜宾职业技术学院五粮液技术学院，四川宜宾644003；2.华中农业大学食品科学技术学院，湖北武汉430070；3.云南农业大学食品科学技术学院，云南昆明650000）

我国传统的开菲尔乳酒是在鲜奶中加入天然发酵剂，经自然发酵形成，但由于天然发酵剂中菌群结构各异致使传统乳酒产品质量经常出现不稳定现象[1-4]。因此菌群结构稳定且能显著提高乳酒感官特性的发酵剂将受到广泛地关注[5-8]。闵建等发现制备乳酒时使用两种及两种以上菌种可以提供产品质量，当酵母菌联合乳酸菌，乳酒的品质能得到显著提升[9-12]。由开菲尔菌生产的开菲尔酸奶不仅与普通酸奶有类似的营养价值，而且具有一定的保健功能[13-16]。当酿酒酵母与其他适宜的微生物混合作为发酵剂发酵酒品时，可以改善酒品的风味，增强酒品的香气特征[17-20]。因此试验以开菲尔菌与酿酒酵母为发酵剂制备新型开菲尔乳酒，并通过优化其发酵工艺条件，以期开发出一种酒体风味优雅、口感幼滑、酸度适中的新型开菲尔乳酒，为后续工业化生产提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

酿酒酵母菌（Saccharomyces cerevisiae）沪酿2.069、开菲尔菌粒（Kefir）：宜宾职业技术学院菌种保藏中心；纯牛奶（乳糖含量4.5%）、白砂糖：市售；柠檬酸、柠檬酸钠、冰乙酸、乙酸钠、磷酸氢钠、乙醚等（均为分析纯）：成都科龙有限公司；2-辛醇：美国Sigma公司。

1.2 仪器与设备

MC-GNP-9080系列隔水式恒温培养箱：青岛明成环保科技有限公司；FA20043型电子天平：上海越平科学仪器有限公司；SW-CJ-1D型超净工作台、PHS-25型精密pH计：上海力辰科技有限公司；KL-30-10000型乳化均质机：上海科劳机械设备有限公司；AT6000型酒精度测试仪：意大利盖博分析仪器公司；GC126型气相色谱仪、DB-Wax（30m×0.25mm×0.25μm）毛细管柱：美国安捷伦公司。

1.3 开菲尔乳酒发酵工艺流程

牛奶、白砂糖、亚硫酸钠→加热至60℃→15 MPa压力条件下均质→90℃加热杀菌5 min→冷却→接入开菲尔菌粒与酿酒酵母→发酵→后熟→成品

操作要点：在牛奶中添加一定比例的白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，搅拌至白砂糖完全溶解，利用柠檬酸盐缓冲液调节pH值为6.5，过滤后加热至60℃，进入乳化均质机（压力为15 MPa）均质，均质后在90℃加热杀菌5 min；待样品冷却后，在无菌条件下接入一定量的经活化后的酵母菌悬液和开菲尔菌粒，25℃发酵，待发酵完成后置于4℃的冰箱中后熟24 h。

1.4 试验方法

1.4.1 理化指标测定方法

总糖（以葡萄糖计）测定：斐林试剂法[21]；酒精体积分数测定：密度瓶法[21]；总酸测定：电位滴定法[21]；氨基酸态氮测定：甲醛滴定法[21]。

1.4.2 乙酸乙酯的检测

乙酸乙酯的检测采用液-液微萃取法提取和气相色谱法定量分析[22-23]。在5 mL发酵液中分别加入5 μL内标（2-辛醇）和500 μL乙醚。待乙醚充分萃取后取有机相进行色谱分析。色谱条件为：进样口温度设定为250℃，取1 μL的样品，设置分流比1∶1，载气流速2 mL/min，氢气流速40 mL/min，空气流速450 mL/min。升温条件为：起始温度150℃，保持3 min，随后以10℃/min的升温速率升温至230℃，保留2 min。

1.4.3 感官评价

由13位三级品酒师组成的评定小组参照王璐等对马奶酒发酵条件的研究[2]及GB/T 23546-2009《奶酒》[21]对新型开菲尔乳酒从色泽（满分5分）、组织形态（满分5分）、香气（满分30分）、滋味（满分40分）、典型性（满分20分）5个方面进行感官评价，如表1所示。

表1 新型开菲尔乳酒的评分标准Table 1 Evaluation standards of new Kefir koumiss

1.4.4 开菲尔乳酒发酵工艺条件的单因素试验

依次考察白砂糖添加量（6%、8%、10%、12%、14%）、开菲尔粒接种量（0.6%、0.9%、1.2%、1.5%、1.8%）、酿酒酵母接种量（0.0%、0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%）及发酵时间（2、3、4、5、6 d）对新型开菲尔乳酒感官评分及乙酸乙酯含量的影响，以确定较佳的白砂糖添加量、开菲尔粒接种量、酿酒酵母接种量、发酵时间。

1.4.5 开菲尔乳酒发酵工艺条件的响应面优化试验

在较优的基础上，根据响应面试验设计原理，进行分析试验[24]，以确定新型开菲尔乳酒最佳的酿造工艺条件，因素水平如表2所示。

表2 新型开菲尔乳酒发酵工艺条件优化响应面试验因素与水平Table 2 Factors and levels of response surface experiments for fermentation process optimization of new Kefir koumiss

1.5 数据分析处理方法

试验采用OriginPro 12.1软件进行数据制图，PASW Statistics 18软件进行数据分析，Design Expert 10.1软件进行响应面设计及结果分析。

2 结果与分析

2.1 单因素试验

2.1.1 白砂糖添加量对新型开菲尔乳酒品质的影响

白砂糖添加量对新型开菲尔乳酒品质的影响见图1。

图1 白砂糖添加量对新型开菲尔乳酒品质的影响Fig.1 Effect of sugar addition on quality of new Kefir koumiss

由图1可知，当开菲尔乳酒中白砂糖添加量从6%增加到12%，开菲尔乳酒的感官评分也随之增加；当添加量达到12%时，开菲尔乳酒的感官评分达到最高分（82.3±0.8）分。但随着白砂糖添加量的继续增加，开菲尔乳酒的感官评分开始呈现出逐渐下降的趋势。发酵醪液中乙酸乙酯的含量随白砂糖添加量的增加而增加，最高达到了（0.75±0.02）g/L。可发酵性糖在开菲尔乳酒发酵过程中主要转化为乙醇，也可以转化成酸类、酯类、醛类等物质[8]。开菲尔乳酒在发酵过程中，可发酵性糖偏少会出现酒体不丰满、香味不足的现象，而可发酵性糖过多则会造成酒体酸度偏大等不良现象。故选用白砂糖添加量为10%、12%及14%用于后续响应面法试验。

2.1.2 开菲尔粒接种量对新型开菲尔乳酒品质的影响

开菲尔粒主要由乳酸菌、酵母菌、醋酸菌及明串珠菌等多种微生物组成，在开菲尔乳酒发酵过程中会产生丁二酮、乙醇、丙醛、羟丁酮等挥发性羰基化合物，从而赋予开菲尔乳酒独特的风味[13，25]。其用量的多少将直接决定着开菲尔乳酒质量的好坏，开菲尔粒接种量对新型开菲尔乳酒品质的影响如图2所示。

图2 开菲尔粒接种量对新型开菲尔乳酒品质的影响Fig.2 Effect of Kefir inoculums on quality of new Kefir koumiss

由图2可知，开菲尔乳酒的感官评分随着开菲尔粒接种量的增加而呈现出先增高后降低的趋势，当开菲尔粒接种量为1.2%时，开菲尔乳酒的感官评分达到最高的（80.2±0.6）分。因开菲尔粒接种量不足会造成开菲尔乳酒发酵不完全，酸味不足、香味较寡淡等不良特征，接种量过大又会使开菲尔乳酒呈现出较高的酸度，甚至出现苦味（特别是在开菲尔粒接种量为1.8%时）。但开菲尔乳酒中乙酸乙酯的含量随开菲尔粒接种量的增加而呈现出不断增加的趋势，最高达到了（0.71±0.05）g/L。综合感官评分与乙酸乙酯的含量变化，选择开菲尔粒接种量为0.9%、1.2%、1.5%作为后续响应面试验的因素水平。

2.1.3 酿酒酵母接种量对新型开菲尔乳酒品质的影响

酿酒酵母接种量对新型开菲尔乳酒品质的影响见图3。

图3 酿酒酵母接种量对新型开菲尔乳酒品质的影响Fig.3 Effect of Saccharomyces cerevisiaeon inoculums on quality of new Kefir koumiss

由图3可知，当酿酒酵母接种量在0.4%以内变化时，开菲尔乳酒的感官评分随着酿酒酵母接种量的增加而不断增加。当酿酒酵母接种量为0.4%时，开菲尔乳酒的感官评分达到最高的（82.4±0.9）分。酿酒酵母在发酵过程中能将可发酵性糖转化为二氧化碳和乙醇，同时还会产生其它一些醇、醛、酸、酯等香味物质[17-18]。当酿酒酵母接种量偏低时，容易使酿酒原料不能完全发酵，造成开菲尔乳酒酒度偏低、酒香不突出等现象。当酿酒酵母的接种量为0.5%时，其开菲尔乳酒的感官评分较酿酒酵母接种量为0.4%时略有下降，但两者并无显著性差异（p＞0.05）。开菲尔乳酒中乙酸乙酯的含量随酵母接种量的增加而不断增加，最高达到了（0.79±0.04）g/L。因此，选择酿酒酵母接种量为0.3%～0.5%用于响应面法试验。

2.1.4 发酵时间对新型开菲尔乳酒品质的影响

发酵时间对新型开菲尔乳酒品质的影响如图4所示。

图4 发酵时间对新型开菲尔乳酒品质的影响Fig.4 Effect of fermentation time on quality of new Kefir koumiss

由图4可知，开菲尔乳酒的感官评分随着发酵时间的延长而增加，当发酵时间为6 d时，开菲尔乳酒的感官评分达到最高的（82.0±0.5）分。虽然开菲尔乳酒的感官评分在其发酵5 d时较发酵6 d时偏低，但二者并无显著性差异（p＞0.05）。开菲尔乳酒中乙酸乙酯的含量也随发酵时间的延长而增加，当发酵时间为6 d时，开菲尔乳酒中乙酸乙酯的含量达到了（0.87±0.05）g/L。当发酵时间少于5 d时，醪液中的可发酵性糖还未完全被微生物所利用，酒体略显寡淡，乙酸乙酯等酒香物质含量偏低，使得开菲尔乳酒的酒香不够浓郁。因此选择发酵时间为4、5、6 d用于后续试验。

2.2 响应面法试验

根据Box-Benhnken中心组合试验设计原理与试验，对白砂糖添加量、开菲尔粒接种量、酿酒酵母接种量、发酵时间4个因素分析得到以下试验方案及结果见表3。

表3 新型开菲尔乳酒发酵工艺条件优化响应面试验设计及结果Table 3 Design and results of response surface experiments for fermentation process optimization of new Kefir koumiss

再通过Design-Expert软件对响应面法试验得到的感官评分与乙酸乙酯含量进行方差分析，得到结果如表4与表5所示。

表4 感官评分的回归模型方差分析Table 4 Variance analysis of regression model for sensory score

表5 乙酸乙酯含量的回归模型方差分析Table 5 Variance analysis of regression model for the content of ethyl acetate

由表4可知，4个因素对新型开菲尔乳酒感官评分影响的强弱顺序依次为：白砂糖添加量＞开菲尔粒接种量＞发酵时间＞酿酒酵母接种量，其中白砂糖添加量对开菲尔乳酒感官评分的影响极为显著（p＜0.01）。白砂糖添加量与开菲尔粒接种量之间具有显著的交互作用（p＜0.05）。设白砂糖添加量、开菲尔粒接种量、酿酒酵母接种量、发酵时间分别为A、B、C、D，以新型开菲尔乳酒的感官评分为响应值，经多元回归拟合后，得到新型开菲尔乳酒感官评分回归方程：新型开菲尔乳酒感官评分=87.48+1.85A-0.66B+0.19C-0.65D-2.25AB-0.025AC+0.62AD+0.27BC-0.85BD-1.02CD-3.15A2-4.44B2-2.74C2-1.62D2

由表5知，A、B、C、D 4个因素中A因素对新型开菲尔乳酒乙酸乙酯含量的影响显著（p＜0.05），交互项AB对乙酸乙酯含量的影响显著（p＜0.05），二次项A2、B2、C2、D2对乙酸乙酯含量的影响极显著（p＜0.01），得到的新型开菲尔乳酒乙酸乙酯含量的回归方程：乙酸乙酯含量=0.900+0.0140A-0.007B+0.007C-0.007D-0.023AB-0.015AC+0.006AD+0.003BC-0.009BD-0.010CD-0.035A2-0.054B2-0.029C2-0.025D2

响应面图形是响应值对各试验因子所构成的三维空间的曲面图，从响应面分析图上可形象地看出最佳参数及各参数之间的相互作用[26-30]。根据新型开菲尔乳酒感官评分回归方程与乙酸乙酯含量的回归方程得出不同因子的响应面分析图结果见图5与图6。

图5 各因素交互作用对新型开菲尔乳酒感官评分的响应面曲线及等高线Fig.5 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on sensory evaluation of new Kefir koumiss

由图5知，A（白砂糖添加量）与B（开菲尔粒接种量）之间所形成的响应面曲面坡度在两因素交互作用响应面图中最为陡峭即A与B相互之间具有最强的交互作用。该结果与表4方差分析所得的白砂糖添加量与开菲尔粒接种量之间具有显著的交互作用（p<0.05）的结论相吻合。

图6 各因素交互作用对新型开菲尔乳酒乙酸乙酯含量的响应面曲线及等高线Fig.6 Response surface plots and contour line of effects of interaction between each factors on the content of ethyl acetate in new Kefir koumiss

由图6知，A与B之间所形成的响应面曲面坡度在乙酸乙酯含量为响应值的两因素交互作用响应面图中最为陡峭即A与B相互之间具有最强的交互作用，与表5方差分析的结论相吻合。

通过响应面分析确定新型开菲尔乳酒的最佳发酵工艺条件为白砂糖添加量12.89%、开菲尔粒接种量1.19%、酿酒酵母接种量0.43%及发酵时间4.82 d，此条件下由公式算出的感官评分与乙酸乙酯含量的理论值分别为87.86分、0.954 g/L。根据所得的分析数据进行3组验证试验，验证试验的条件为白砂糖添加量12.9%、开菲尔粒接种量1.2%、酿酒酵母接种量0.4%及发酵时间115 h，得到新型开菲尔乳酒的感官评分为（88.1±0.3）分、乙酸乙酯的含量为（0.95±0.01）g/L，测定结果稳定，偏差不大，证明该结果合理可靠。

2.3 开菲尔乳酒的理化分析及感官分析

测定在最佳发酵工艺条件下新型开菲尔乳酒（Z1）及在最佳发酵工艺条件下但未接入酿酒酵母的开菲尔乳酒（Z0）的总糖、酒精度、总酸、氨基酸态氮、乙酸乙酯等理化指标及感官评分，其数值见表6。

由表6可知，Z1的酒精度、总酸、氨基酸态氮、乙酸乙酯及感官评分均高于Z0，特别是乙酸乙酯的含量是Z0的1.76倍，表明酿酒酵母在新型开菲尔乳酒发酵过程中能赋予产品风味特别是能赋予更加浓郁的乙酸乙酯酒香进而提高产品的感官特性。其原因是酿酒酵母与醋酸菌等其它微生物共同接入发酵醪液中，会促进乙酸乙酯等风味物质的生成[31-32]。Z1呈现出色泽微黄、澄清透明、奶香与酒香和谐、酒体丰满圆润、醇厚协调的感官特性；而Z0在酒香和酒体滋味方面较Z1有所欠缺，因而开菲尔菌与酿酒酵母混合发酵有利于提高新型开菲尔乳酒的感官特性。

表6 两种开菲尔乳酒的理化指标及感官评分Table 6 Physicochemical indexes and sensory scores of two kinds of Kefir koumiss

3 结论

在单因素试验的基础上采用响应面法对新型开菲尔乳酒的发酵工艺条件进行了优化，确定了其最优工艺条件为：在牛奶中添加12.9%的白砂糖及0.02%的亚硫酸钠，搅拌至白砂糖完全溶解，过滤后加热至60℃，进入乳化均质机（压力为15 MPa）均质，均质后在90℃加热杀菌5 min；待样品冷却后，在无菌条件下接入1.2%的开菲尔粒和经活化后的0.4%酿酒酵母悬液，25℃发酵115 h后置于4℃的冰箱中后熟24 h。此条件下可获得色泽微黄透明、奶香与酒香和谐、酒体丰满圆润的开菲尔乳酒，其感官评分为88.1分、乙酸乙酯的含量为0.95 g/L。若需将此开菲尔乳酒进行工业化生产还需对酒体进一步勾调及澄清处理，使其感官特性符合商品要求。