荷丹调脂方对小鼠脂质代谢的影响

蔡琳玲，方丽文，刘子修

(1.东南大学附属中大医院，江苏 南京 210009；2.中国人民解放军东部战区空军医院药学部，江苏 南京 210002)

高血脂症是一种以血脂异常为主要特征的代谢综合征，是动脉粥样硬化、冠心病、脂肪肝的诱发因素之一[1]。临床上运用他汀类药物治疗高血脂症，虽然能够显著降低血浆中的总胆固醇(TC)、总甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-c)，升高高密度脂蛋白胆固醇(HDL-c)，降低心脑血管疾病的发病率，但他汀类药物能够引起胃肠道反应、肝损伤以及横纹肌溶解症等毒副反应[2]。荷丹调脂方是由荷叶、丹参、补骨脂、山楂及番泻叶组成的复方中成药，荷叶行气祛湿、丹参活血化瘀、山楂理气消食、番泻叶润肠通便、补骨脂温补肝肾，具有活血化瘀、补肝益肾、化痰降浊等功效，进而降低血脂，同时临床运用鲜有不良反应的报道。国内很多基础及临床实验中已经证实荷丹调脂方具有降脂、减体质量和改善胰岛素抵抗的作用。本研究通过液质联用及数学建模的方式筛选出荷丹调脂方能够显著调节的脂质种类，丰富临床用药的依据。

1 材料

1.1 药物

荷丹调脂方主要由荷叶、山楂、丹参、补骨脂(盐炒)、番泻叶。购自南京鹤龄有限公司，由周惠英主管药师鉴定为合格正品。

1.2 血清样本

由南京中医药大学提供，包括：正常饮食饲喂4周大鼠血清50 μL、高脂饮食饲喂4周大鼠血清50 μL、荷丹调脂方灌胃给药(600 mg/kg)+高脂饮食饲喂4周大鼠血清50 μL。

1.3 试剂

HPLC级甲醇、乙腈、异丙醇、甲基叔丁基醚(Merck，德国)，HPLC级甲酸、甲酸铵(ROE，美国)。

1.4 仪器

LTQ/OrbitrapxL质谱仪、UltiMate 3000型超高效液相色谱，Millipore Synergy型超纯水系统(Merck，德国)，KQ-500B型超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。

2 方法

将-80 ℃冻存的小鼠血清于4 ℃解冻，精密吸取20 μL血清于1.5 mL离心管中，加入225 μL含内标[Lyso PE(17∶1)，SM(17∶0)，PE(17∶0/17∶0)浓度约为5 μg/mL]的冰甲醇，涡旋10 s，加入750 μL MTBE再次涡旋10 s，于4 ℃震荡10 min，加入188 μL超纯水，涡旋20 s后于4 ℃，14 000 r/min离心2 min，吸取350 μL上清液至1.5 mL离心管中，置于离心浓缩仪中挥干。挥干的样品用110 μL复溶液(甲醇∶甲苯=9∶1)进行复溶，即涡旋10 min，超声10 min，14 000 r/min离心10 min后取上清进样分析[3]。

3 脂质组学及分析

3.1 色谱条件

色谱柱为Hypersil GOLD aQ柱(Thermo Fisher，2.1 mm×150 mm,3 μm)。流动相：A为含0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸铵的乙腈/水溶液(40∶60,V/V)，B为含0.1%甲酸和5 mmol/L甲酸铵的异丙醇，乙腈溶液(9∶1,V/V)。梯度洗脱程序：0～l min，20%B；1～21 min，20%～100%B；21～25 min，100%B；25～30 min，20%B。流速：0.35 mL/min；柱温：55 ℃；自动进样器温度：4 ℃；进样量2 μL[4]。

3.2 质谱条件

仪器使用Thermo LTQ Orbitrap XL，电喷雾离子源(ESI)，正负离子电离模式，正离子喷雾电压为4.80 kV，负离子喷雾电压为4.50 kV，鞘气40 arb，辅助气15 arb。毛细管温度325 ℃，毛细管电压35 V/-15 V，管透镜电压50 V/-50 V，以分辨率60 000进行全扫描，扫描范围50～1 000，并采用CID进行二级裂解，碰撞电压为30 eV，同时采用动态排除(重复计数为2)去除无必要的MS/MS[5]。

3.3 质量控制

在进行基于质谱技术的代谢组学研究时，为了获得可靠且高质量的代谢组学数据，通常需进行质量控制(QC)与质量保证(QA)工作。通过QC，可以获取整个实验的系统误差是否在可控范围内；通过QA，剔除不可靠的变量，可以将分析误差控制在不影响多变量统计分析结果的范围内。若QC的误差在2 SD以内，则QC样本聚集系统可靠。对于QA，FDA建议用于生物标记物分析的RSD小于30%是可以接受的，因此对RSD大于30%的变量在后续生物标记物发现过程中进行剔除，由此将QA的RSD控制在30%以内[6]。

4 数据分析

4.1 主成分分析(PCA)

PCA是一种运用线性代数的数据降维方法，为无监督分析方法，能够反映数据的原始状态。PCA将代谢物变量按一定的权重通过线性组合后产生新的特征变量，通过主要新变量(主成分)对各组数据进行归类，因无外加人为因素，得到的PCA模型反映了代谢组数据的原始状态，有利于掌握数据的整体情况并对数据从整体上进行把握，有利于发现和剔除异常样品，提高模型的准确性。

4.2 主坐标分析(PCoA)

PCoA是一种线性代数的处理方式，该模型能够展示样本间相似性，它的分析思路与PCA分析基本一致，都是通过降维方式寻找复杂样本中的主要样本差异距离。与PCA不同的是，PCoA主要利用Unifrac、Bray-Curtis等样本距离信息进行计算以及降维图形展示，因此结果更集中于体现样本间的相异性距离。

4.3 非度量多维尺度分析(NMDS)

NMDS是一种将多维空间的研究对象(样本或变量)简化到低维空间进行定位、分析和归类，同时又保留对象间原始关系的非线性数据分析方法。NMDS模型适用于无法获得研究对象间精确的相似性或相异性数据，其设计目的是为了克服线性模型(包括PCA、PCoA)的缺点，更好地反映生态学数据的非线性结构。

4.4 正交偏最小二乘判别分析(OPLS-DA)

OPLS-DA是一种有监督的判别分析，首先使用正交信号校正技术，将自变量X矩阵信息分解成与因变量Y相关和不相关的两类信息，然后将与Y相关的信息集中在第一个主成分方向，不相关信息放在其他主成分方向。R2X、R2Y、Q2Y分别表示OPLS-DA模型自变量的可解释方差和百分比、模型因变量的可解释方差和百分比及模型的可预测度。

4.5 差异代谢物筛选条件选择

代谢组学差异代谢物筛选可结合采用单变量分析和多元数据分析或选择其中一种。用于筛选差异代谢物的单变量数据分析,包括2组间比较的t检验(ttest)和差异倍数分析(FC)，多组件比较的方差分析(ANOVA)；多元数据分析为偏最小二乘判别分析(PLS-DA)和OPLS-DA。相关差异代谢物筛选条件有：

①P-value≤0.05+VIP≥1；(t test,PLS-DA/OPLS-DA)

②P-value≤0.05+fold_change≥1.5或≤0.667；(t test,FC)

③P-value≤0.05+VIP>=1+s-plot.pcorr≥0.8；(t test,FC,PLS-DA/OPLS-DA)

④one-way ANOVAP-value≤0.05；(one-way ANOVA)

⑤two-way ANOVAP-value≤0.05.(two-way ANOVA)

本次研究采用条件②筛选差异脂质代谢物。

5 结果

5.1 PCA分析结果

采用对照组(C)、模型组(M)以及荷丹调脂方组(T)3组样品建立PCA模型，模型第一主成分(PC1)解释了代谢组方差和的35.9%，第二主成分(PC2)解释了方差和的14.4%，模型质量较好。以第一和第二主成分绘制3组样品的PCA得分图(图1)，由图可知，对照组(C)、模型组(M)以及荷丹调脂方组(T)组间存在分组趋势，无异常样本。

5.2 PCoA分析结果

由PCoA图(图2)可知对照组(C)、模型组(M)以及荷丹调脂方组(T)样品按照分组分别聚集为3组，显示了各组间样本的差异较大；PCoA模型中第一主成分(PCo1)解释的自变量差异为64.5%，模型第二主成分(PCo2)解释的自变量差异为12.4%。

5.3 NMDS分析结果

由图3可知，对照组(C)和模型组(M)样本分开，显示了2组间样本差异较大；荷丹调脂方组(T)和模型组(M)样本分开，显示了2组间样本差异较大；对照组(C)和荷丹调脂方组(T)存在交集，2组样本不能明显分开，显示了组间样本的相似性。模型应力stress一般在0.2以内则可接受，本次建模stress=0.035，显示了极佳的拟合效果。

5.4 OPLS-DA分析结果

OPLS-DA模型用于进一步分析3组样品间差异的显著性。由得分图可知，对照组与模型组以及模型组与荷丹调脂方组两两组间的模型解释的代谢组差异分别为32%和39%，解释的分组信息差异分别为95.4%和78.8%，对分组信息的预测性为0.761和0.659，数学建模较为合理。得分图中两两组间样本存在分离趋势，显示了两两组间代谢物的差异性。为了进一步分析组间差异的显著性，使用排列交叉验证(Permutation test)来评估OPLS-DA模型是否过度拟合(Overfitting)。随机模型质量用R2Y和Q2表示，由图可知对照组与模型组随机模型R2Y和Q2的经验性P值分别为0.005和0.005，未出现过度拟合情况，2组样品差异显著；荷丹调脂方组与模型组间随机模型R2Y和Q2的经验性P值分别为0.105和0.01，也未出现过度拟合情况，2组间差异也达到了显著水平。因而，本实验建立的OPLS-DA模型具有较高的可靠性，建模方式成功，荷丹调脂方对小鼠血浆脂质代谢网络产生了较大影响。OPLS-DA得分图以及排列交叉验证结果见图4。

5.5 差异脂质代谢物筛选结果

差异代谢物的相对含量及名称、统计学参数分别见表1～2。

表1 筛选出的由药物调节的差异脂质代谢物

表2 差异脂质代谢物的统计学参数

5.6 差异代谢物统计结果

荷丹调脂方能够显著降低模型组甘油三酯(TG)，包括TG 50∶3、TG 52∶4、TG 54∶5、TG 54∶6、TG 56∶5在血浆中的含量；荷丹调脂方能够显著升高模型组磷脂酰胆碱(PC)、溶血磷脂酰胆碱(LysoPC)包括：LysoPC 20∶2、LysoPC 23∶0、PC 34∶1、PC 36∶2、PC 36∶4、PC 38∶1在血浆中的含量。组间差异代谢物量化图见图5。

6 讨论

血脂异常是心脑血管疾病中极为重要的致病危险因素,减少外源性脂质的摄入、降低内源性脂质的合成及增加机体脂质代谢能力是目前调控血脂的重要思路。血液中的脂质主要以脂蛋白的形式在血浆中转运，共同维持机体血脂的稳态，脂蛋白的组成主要包括甘油三酯类、胆固醇酯(CE)类、磷脂类以及相应的载脂蛋白。PC是目前公认的最具有生物学活性的磷脂，被广泛地运用在生物医药领域[7]。血浆中的脂质多以载脂蛋白嵌入磷脂包裹的脂质核心的脂蛋白颗粒形式在血浆中运输，其中PC起到亲和极性载脂蛋白与非极性脂质的作用。PC在卵磷脂胆固醇酰基转移酶(LCAT)催化下能够转化为LysoPC，同时生成一分子游离脂肪酸(FFA)，FFA再同外周组织、巨噬细胞等转移出的游离胆固醇一起形成CE，减少了胆固醇在外周组织、巨噬细胞的沉积，从而降低动脉粥样硬化的发病风险[8]。因此，较高水平的PC、LysoPC反映了血浆脂质的转运能力。TG是一种可供外周组织利用的供能物质，对于其是否直接增加心脑血管突然事件的发生率尚存在争议，但临床调查显示血浆中过高的TG含量是诱发心脑血管疾病突发事件的独立风险因素[9]。

对荷丹调脂方的药理学研究已经证实了其能够升高LCAT，加速脂质的逆向转运，减少脂质在血管壁的沉积，降低血液黏稠度，保护血管内皮的完整性，同时还能降低血浆炎症因子水平，发挥抗心脑血管疾病的作用[10]。通过UPLC-MS以及多种数学建模分析(PCA、PCoA、NMDS、OPLS-DA)验证了荷丹调脂方对高脂饮食小鼠血浆脂质的调节和改善作用，荷丹调脂方通过升高能够促进血浆脂质转运的6种PC、LysoPC含量，促进外周游离胆固醇的酯化，被载脂蛋白携带最终转运回肝脏代谢，从而降低了血浆胆固醇的含量；同时给予荷丹调脂方能够显著降低血浆中由于造模而升高的5种TG，从而部分降低血液的黏稠度，降低对血管壁的机械性损伤。由于方法学的限制，我们在分析中没有得到完整的胆固醇类组分，但对检测出的几种CE的量化统计显示了荷丹调脂方降低了模型组显著升高的血浆胆固醇，这样的结果与临床报道一致。总之，我们的研究结果证实了荷丹调脂方的降脂作用，丰富了其临床用药的依据，同时筛选出了药物显著性调控的脂代谢产物，为进一步阐明荷丹调脂方参与调控的脂代谢靶点和相关通路提供了思路。