核壳型Fe3O4@PDA@Au纳米材料对水牛角含巯基肽类成分的富集研究

刘婷，韩疏影，康安，邓海山，朱栋，池玉梅，刘睿,2,3

(1.南京中医药大学药学院，江苏 南京 210023；2.江苏省海洋药用生物资源研究与开发重点实验室，江苏 南京 210023；3.南京中医药大学江苏省中药资源产业化过程协同创新中心/中药资源产业化与方剂创新药物国家地方联合工程研究中心，江苏 南京 210023)

水牛角(Bubali Cornu)是中医临床及中药制药行业的重要品种，始载于《名医别录》，具清热、镇静的功效。水牛角功效特点突出，水煎液中肽类成分为主要功效物质，其中含巯基(-SH)肽类物质为重要特征性物质，与水牛角清热作用密切相关[1-2]。前期研究表明，口服角类提取物后可显著提高大鼠血浆中-SH水平[3]。然而作为特征性物质及潜在效应物质，含-SH肽类成分丰度很低，需进一步富集及表征。

现代研究表明，多种含-SH类生物分子在自然界和生物体内广泛存在，如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(HCys)及谷胱甘肽(GSH)等，这些含-SH化合物参与生物体的新陈代谢过程并对维持体内平衡发挥着重要的作用；同时，生物体内-SH水平的高低与临床疾病相关，如人体的肝损伤[4]，心脑血管病[5]等。基于此，本文制备一种纳米材料，对水牛角含-SH肽类成分进行富集，有利于水牛角功效物质基础的系统阐明。

含硫及含-SH类物质与金纳米材料之间可形成金-硫键(Au-S)，并在金纳米材料表面形成单分子层[6]；而吸附在金纳米材料表面的含-SH类物质可通过二硫苏糖醇(DTT)进行洗脱。但由于单独的金纳米粒子对含-SH类成分进行富集存在操作复杂、耗时较长等问题，因此本文将磁性材料与金纳米结合，制备出核壳型Fe3O4@PDA@Au纳米材料对水牛角含-SH肽类成分进行富集研究，并取得良好效果。

1 材料

JEM-2100F型场发射透射电子显微镜(TEM，日本电子公司)；酶标仪(美国Thermo Scientific公司)，离心浓缩仪(美国Labconco公司)。

三氯化铁(FeCl3·6H2O)、无水乙醇(C2H5OH)、乙二醇(EG)、无水乙酸钠(NaOAc)、氢氧化钠(NaOH)、二甘醇(DEG)及EDTA购于国药集团化学试剂有限公司)；四氯金酸(HAuCl4·4H2O)、盐酸多巴胺(DA·HCl)、盐酸羟胺(NH2OH·HCl)、二硫苏糖醇(DTT)购于上海麦克林生化科技有限公司；5，5′-二硫代硝基苯甲酸(DTNB)购于阿拉丁试剂(上海)有限公司；四羟甲基氯化磷(THPC)购于江苏汉邦科技有限公司；三羟甲基氨基甲烷(Tris)购于生工生物工程(上海)股份有限公司；乙腈(CH3CN)购于德国默克公司；实验用水均为经Milli-Q系统净化的二次去离子水。Waters Seppak C18固相萃取小柱购于美国Waters公司，多肽测定试剂盒购于赛默飞世尔科技(中国)有限公司，人工胃液、人工肠液购于上海源叶生物有限公司。

水牛角药材收集于江苏省淮安市，经南京中医药大学段金廒教授鉴定为正品。

2 方法

2.1 Fe3O4@PDA@Au核-壳纳米粒子的制备

2.1.1 Fe3O4纳米粒子的制备 称取1.08 g FeCl3·6H2O和4.0 g NaOAc于烧杯中，加入14 mL EG和26 mL DEG，磁力搅拌均匀后，将黄色溶液转移至聚四氟乙烯内衬的不锈钢高压釜中密封并加热至200 ℃。反应15 h后，将高压釜冷却至室温。将得到的Fe3O4纳米粒子分别用水和乙醇洗涤数次，然后在真空下干燥12 h[7]。

2.1.2 Fe3O4@PDA纳米粒子的制备 称取100 mg上述已制备好Fe3O4，加入50 mL 2 mg/mL的DA溶液(pH 8.5)，室温搅拌4 h，分离，去离子水洗涤多次，分散在纯水中。

2.1.3 Fe3O4@PDA Au seeds纳米粒子的制备 取5 mL上述Fe3O4@PDA分散液于50 mL单口圆底烧瓶，加入20 mL THPC-Au seeds分散液(参考文献方法制备THPC-Au seeds分散液[8])，用1%的柠檬酸调节溶液pH为2～3，搅拌0.5 h后，在外加磁场下分离产物，以去离子水洗涤多次，最后将制备好的Fe3O4@PDA@Au seeds分散在20 mL去离子水中。

2.1.4 Fe3O4@PDA@Au核-壳纳米粒子的制备 Fe3O4@PDA@Au核-壳纳米粒子的制备主要分为以下几个步骤：①取10 mL上述Fe3O4@PDA@Au seeds溶液于100 mL单口圆底烧瓶中，加入50 mL去离子水，搅拌1 min；②加入0.2 mL 1% HAuCl4，继续搅拌1 min；③加入0.375 mL 0.2 mol/L的NH2OH·HCl，反应10 min；④于反应液中加入0.25 mL 1% HAuCl4及0.125 mL 0.2 mol/L NH2OH·HCl；⑤以上步骤④重复9次，使纳米金在内核表面反复包裹成核-壳结构。所得的Fe3O4@PDA@Au纳米材料经分离、洗涤后，将材料置于60 ℃的真空干燥箱中干燥4 h后取出，在4 ℃条件下密封干燥保存。

2.2 水牛角提取液的制备

将水牛角粉碎后过100目筛，取水牛角粉末约10 g，加入100 mL人工胃液，在37 ℃下恒温水浴搅拌提取2 h，过滤，得滤液；滤渣加入100 mL人工肠液在37 ℃恒温水浴锅中继续搅拌4 h，过滤，合并2次滤液得水牛角样品溶液。

2.3 Fe3O4@PDA@Au核-壳纳米材料对水牛角提取物中含巯基肽类成分的富集与洗脱

取100 mg Fe3O4@PDA@Au核壳纳米材料置于50 mL离心管中，加入40 mL水牛角提取液，将试管置于摇床上振摇2 h后，在外磁场的作用下分离移去上清液，纯水洗涤3次，加入4 mL 20 mg/mL的DTT溶液进行洗脱，洗脱2 h后，在外磁场的作用下分离，得到洗脱液。将水牛角提取液与洗脱液分别用Seppak C18固相萃取小柱脱盐，离心浓缩干燥后保存，待用。

2.4 水牛角提取物及含巯基肽类成分测定与表征

2.4.1 巯基含量测定 取2.3项下样品，纯水复溶，采用Ellman法测定巯基的含量。精密吸取供试品15 μL至96孔细胞培养板中，依次加入165 μL的EDTA溶液和15 μL的DTNB溶液，于412 nm处测定吸光度，以吸光度计算供试品中-SH的浓度[3]。

2.4.2 多肽含量测定 取2.3项下样品，纯水复溶，按照多肽试剂盒说明书进行测定。材料对水牛角中含巯基肽类成分的富集因子(EF)以公式(1)计算：

(1)

其中，Ci和C'i分别为水牛角提取液和洗脱液中巯基的浓度(mmol/L)，Ce和C'e分别为水牛角提取液和洗脱液中多肽的浓度(g/L)。

2.4.3 肽类成分的测定与表征 戴安U3000 NanoRSLC纳升液相系统，色谱柱为5 μm Reprosil C18AQ(75 μm×150 mm)，Thermo Scientific Q Exactive Plus Orbitrap LC-MS/MS系统分析水牛角不同样品。上样量为2 μL，流速300 nL/min，流动相A(乙腈/甲酸/水=2/0.2/98，v/v/v)，流动相B(乙腈/甲酸/水=80/0.2/20，v/v/v)，2%～30%B线性梯度洗脱150 min。喷雾电压为2.5 kV，离子传输毛细管温度为200 ℃；质谱一级全扫描范围为m/z300～2 000，分离宽度为3 Da；串联质谱分析采用一级质谱数据依赖的二级质谱扫描模式，依次选取一级质谱中离子强度最高的5个离子进行碰撞诱导解离(CID)二级串联质谱。采用Xcalibur软件进行数据采集。

二级质谱数据采用PEAKS 8.5软件进行搜库鉴定分析，选择牛科(Bovidae，Uniport下载，bovidae_uniprot-taxonomy_9895，2019-10-28下载)数据库，检索参数设置为：前体离子误差10×10-6；子离子误差1 u；甲硫氨酸残基可变修饰(氧化+15.99 u)；N-端乙酰化(+42.01 u)；氨基甲酰化(+43.01 u)；允许2个位点误切，假阳性率(FDR)≤1%；选择酶切方式：非酶切(No enzyme)；其他参数为默认参数，在上述检索条件下所得分值有显著性意义(P<0.05)被认定为有效的鉴定结果。

3 结果

3.1 Fe3O4@PDA@Au核-壳纳米材料的制备

Fe3O4@PDA@Au核-壳纳米粒子材料的制备如图1所示。

Fe3O4@PDA@Au核-壳纳米材料制备过程的透射电镜(TEM)如图2所示，a～c分别为Fe3O4、Fe3O4@PDA及Fe3O4@PDA@Au的TEM图。图2a所示，Fe3O4原粒径约为100 nm，DA在碱性溶液中易发生氧化自聚并在基质表面形成PDA层，自聚后形成的Fe3O4@PDA为球型结构，其中PDA厚度约为10 nm(图2b)；THPC还原HAuCl4·4H2O形成THPC-Au seeds均匀的分布在Fe3O4@PDA表面；NH2OH·HCl还原HAuCl4·4H2O，在THPC-Au seeds表面不断生长和包裹，最终形成金纳米壳层(图2c)，即Fe3O4@PDA@Au核-壳纳米材料。

3.2 水牛角提取物中含-SH肽类成分的富集

采用Fe3O4@PDA@Au纳米材料对水牛角提取液进行富集，测定水牛角提取液及富集液中-SH含量与多肽浓度，结果见表1。

表1 水牛角提取液和富集液中-SH及多肽的含量对比

通过2.4项下公式计算出Fe3O4@PDA@Au纳米材料对水牛角中含-SH肽类成分的EF为23.40，表明Fe3O4@PDA@Au纳米材料对水牛角中含-SH肽类成分具有良好的富集效果。

3.3 水牛角提取液及富集液中含-SH肽类成分的鉴定

水牛角富集液中含-SH肽类成分显著高于水牛角提取液，为明确水牛角提取液与富集液中含-SH肽类的组成，采用nano LC-MS/MS对提取液和富集液中肽类成分进行鉴定，结果从水牛角提取液中共鉴定了4 114个肽段信息，其中含有Cys残基的肽段共11个(一分子Cys含一个-SH基团)，均为仅含1个Cys残基的肽段，含Cys残基的肽段与总肽段的比值为0.003；从洗脱液中共鉴定了2 254个肽段信息，其中含有Cys残基的肽段共709个，含3个Cys残基的肽段6个，含2个Cys残基的肽段50个，仅含1个Cys残基的肽段653个，含Cys残基的肽段与总肽段的比值为0.314。研究结果亦表明Fe3O4@PDA@Au纳米材料能够较好的富集水牛角中含-SH肽类成分。

水牛角含有丰富的角蛋白，角蛋白存在的大量二硫键(-S-S-)在提取后会发生断裂，从而形成含-SH肽段，以富集液中所含的肽段GGVVCGDLCVSGSRPVTG为例，其MS/MS谱如下图3所示，根据二级质谱中一系列的b离子与y离子信息及蛋白质库比对，可确定其氨基酸序列为GGVVCGDLCVSGSRPVTG，来源于角蛋白81(Q148H4，KRT81_BOVIN Keratin, type Ⅱ cuticular Hb1)的G433-G450氨基酸残基，含有2个Cys残基，即含有两个-SH，为典型的含-SH多肽，可被Fe3O4@PDA@Au纳米材料富集。

3.4 水牛角提取液及富集液中含-SH肽类成分的表征

将水牛角提取液与富集液中鉴定得到的蛋白质采用韦恩图分析，结果有2 881个肽段仅在提取液中被鉴定出来，1 021个肽段仅在富集液中被鉴定出来(其中共含有765个Cys残基)，另外有1 233个肽段为提取液与富集液共有肽段。Cys残基的数量可反映-SH的量，由图4可见，除了水牛角提取液和富集液共有的肽段外，绝大部分含-SH的肽段均在水牛角富集液部分，也表明本文制备的材料对水牛角中含-SH肽类成分进行了高效富集。

对富集含-SH肽段分析发现，其中近60%的含-SH肽段来源于角蛋白(Keratin)，5.5%来源于角蛋白相关蛋白(Keratin-associated protein)，3.7%来源于链接斑珠蛋白(Junction plakoglobin)，3.4%来源于桥粒蛋白(Desmocollin)，2.4%来源于桥粒斑菲素蛋白(Plakophilin)，1.3%来源于桥粒芯蛋白(Desmoglein)，上述蛋白主要为结构蛋白，即构成水牛角致密稳定的蛋白质结构的关键成分，来源于这些结构蛋白质的含-SH肽段占76%。见图5。

富集液中含-SH肽类物质的分子量分布与亲疏水性情况如图6所示，近93%的肽段分子量低于2 000 u，一般认为分子量低于2 000 u的肽段易于透过生物膜而被吸收。我们以总平均亲水值(GRAVY)来表示肽段的亲疏水性，正值代表疏水，负值代表亲水，由图6(B)可见，富集液中含-SH肽类物质约60%的GRAVY值小于0，即含-SH肽类成分以亲水性肽段为主。

4 讨论

角类动物药为传统中药的重要组成部分，主要成分为角蛋白等结构蛋白，一直以来，人们认为角蛋白、角蛋白相关蛋白、连接蛋白等结构蛋白类成分非常稳定，不易溶于水、酸、碱等物质，主要由角蛋白构成的角类动物药的功效物质基础不明确。前期研究发现口服角类药材提取物可显著提高动物血浆-SH水平，这可能与角蛋白、桥粒蛋白等结构蛋白中含有丰富的-S-S-有关：-S-S-在生物体内经过消化降解后暴露出-SH，进而释放出含有-SH的肽类成分，丰富的-SH通过特定的途径进入机体改变血浆-SH水平。这些结果提示我们：水牛角中含-SH肽类成分可能为重要的功效物质基础。

为了将水牛角提取液中含-SH肽类成分高效富集，本文制备了核壳型Fe3O4@PDA@Au纳米材料，通过金纳米与Cys残基中的-SH形成Au-S键将水牛角中含-SH肽类成分特异性的“钓”取出来。从EF值可看出，含-SH肽类成分富集了20倍以上，而肽组学的鉴定结果表明，含-SH肽段数量占比提升了100倍以上。本文为水牛角乃至角类动物药中含-SH肽类成分的富集、分析、表征提供了方法学依据，为后续揭示角类动物药功效物质基础研究提出了思路与研究方向。在此工作基础上，我们后续有必要开展：①水牛角等角类动物药中含-SH肽类成分生物效应的系统评价研究；②明确水牛角等角类动物药指标性成分，以提升质量标准。