木樨草素等抗心肌缺血/再灌注损伤及抑制脂代谢和细胞凋亡作用研究

邹小艳，范香成，田友清，尚靖

(1.中国科学院西北高原生物研究所藏药研究重点实验室，青海 西宁 810007；2.中国科学院西北高原生物研究所青海省藏药药理学和安全性评价研究重点实验室，青海 西宁 810007；3.中国科学院大学，北京 100190；4.中国药科大学天然药物活性组分与功效国家重点实验室，江苏 南京 210009；5.中国药科大学江苏省中药评价与转化重点实验室，江苏 南京 210009；6.江苏医药职业学院药学院，江苏 盐城 224005)

心肌缺血/再灌注损伤(MIRI)治疗的最后壁垒在于，建立心外膜梗死相关动脉通畅性即再灌注的同时，增加额外的心脏保护策略以减少梗死面积和冠状动脉微血管功能障碍。尽管抗MIRI新药研发在动物实验方面取得了成功，但将心脏保护的药理研究结果转化为临床实践却较困难[1-2]。原因可能为病人通常有许多危险因素和共存病，如高龄、糖尿病、高糖血症和高脂血症等。高脂血症除诱导动脉粥样硬化外，还能引起心肌氧化应激、炎症、凋亡增加及线粒体功能障碍等负面作用，甚至消除再灌注治疗策略-缺血预适应和后适应的心肌保护作用[3-4]。越来越多的证据显示MIRI能引起细胞凋亡，凋亡在MIRI病理生理过程中发挥着重要作用。可见，MIRI和脂代谢及凋亡有着紧密的联系，研究药物对脂代谢、凋亡等多方面的作用将有益于系统防治MIRI。

11β-羟基类固醇脱氢酶1型(11β-HSD1)的致危作用包括胰岛素抵抗、血脂异常、高血压和内脏肥胖[5]。溶血磷脂酸酰基转移酶(LPAATs)能催化溶血磷脂酸(LPA)转变为磷脂酸[6]。LPA对调节血小板活化、内皮细胞功能、血管壁的炎症反应及抑制卒中或心肌梗死发生等具有重要作用[7-9]。张力蛋白同系物(PTEN)是激活突变基因和原癌基因PI3K/Akt的主要负调节物，抑制PTEN能提高PI3K/Akt信号，降低凋亡，增加存活，进而保护MIRI[10-12]。蛋白酪氨酸磷酸酶2(SHP-2)是细胞质内广泛表达的非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶[13]，研究表明，SHP-2因去磷酸化作用，能干扰血管生成素对MIRI的保护作用[14]。

香青兰具有补益心脑、活血化瘀等多种功效，针对冠心病、心绞痛等综合症状，可显著改善心肌缺血状况[15-16]，且其提取物具有降血脂作用[17]。基于中药血清化学及血清药理学方法，课题组发现香青兰保护心肌细胞缺氧/复氧损伤的物质基础为木樨草素、山奈酚、木樨草苷[18-20]。木犀草素和山奈酚均能抑制MIRI损伤[21-22]，但木樨草苷对离体大鼠MIRI的保护作用至今未见报道，且这3种化合物对脂质代谢酶类的影响也未曾开展。

本试验基于参与脂代谢相关的酶(11β-HSD1和LPAAT)及细胞凋亡相关蛋白(PTEN和SHR-2)考察了香青兰中木樨草素、山奈酚、木樨草苷对离体大鼠MIRI的保护作用，并对这3种化合物抑制MIRI细胞凋亡机制和其影响缺血性心肌病脂代谢相关靶点进行了探讨，以期为系统防治MIRI提供依据。

1 材料

1.1 试剂

木樨草素(>98%，批号：H1617004，陕西慧科植物开发有限公司)；山奈酚(>98%，批号：B1704016，陕西慧科植物开发有限公司)；木樨草苷(>98%，批号：PMF7070602，成都普瑞法科技开发有限公司)；雷米普利(武汉华怡达科技有限公司)，氨基甲酸乙酯(乌拉坦，上海青析化工科技有限公司)；2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC，中国医药集团有限公司)；胰蛋白酶(美国Invitrogen GIBCO)；高糖DMEM培养基(美国Invitrogen GIBCO)；Bpv(phen)(美国Enzo Life Sciences)；胎牛血清(美国Invitrogen GIBCO)；皮质醇ELISA试剂盒(Biovalue)；可的松(南京宝灵科生物技术有限公司)；NADPH(南京生兴生物技术有限公司)；LPAATβ antibody(美国Santa Cruz Biotechnology)；Goat Secondary Antibodies(美国sigma)；TMB(碧云天生物技术研究所)。PTEN磷酸酶(美国Echelon Inc)；孔雀绿(美国Echelon Inc)；BpV(pic)(美国Enzo Life Sciences)；SHP-2/PTPN11(美国BPS Bio science)；对硝基苯磷酸二钠(pNPP)[梯希爱(上海)化成工业发展有限公司]；二硫苏糖醇(DTT)；HEPES(南京生兴生物技术有限公司)；NSC-87877(CALBIOCHME)。

1.2 动物

雌性SPF级SD大鼠(190～220 g)，80只，购自浙江省实验动物中心，动物许可证号：SCXK(浙)2008-0033。清洁级ICR小鼠(22～25 g)，雌雄不限，购自南京青龙山实验动物中心，许可证号：SCXK(苏)2007-0008。细胞株：LO2肝细胞株(武汉博士德生物工程有限公司)。

1.3 仪器

GL-2离体心脏灌流系统，HW-1000超级恒温水浴，YY-2药液泵，转换器，生理压力传感器(航天医学工程研究所)；BL-420F生物机能实验系统(成都泰盟科技有限公司)；BS210S电子天平(德国Sartorius)；HERA Cell 150细胞培养箱(美国Thermo Scientific)；荧光倒置显微镜(日本Olympus)；LEGEND Micro 21R型离心机(美国Thermo scientific)；Safire 2型微孔板测读仪(瑞士TECAN)。

2 方法

2.1 离体心脏MIRI模型复制

大鼠称质量，用乌拉坦腹腔注射麻醉(1 g/kg)，快速开胸取出心脏，置于Locke-Ringer's冰水液中洗净血液，理出主动脉，迅速转移、固定于Langendorff灌流装置，以充O2的Locke-Ringer's液逆行恒流灌流,温度控制在(37±0.2)℃，主动脉进，右心房出；剪开左心耳，插入球囊，调节体积以灵敏感应为度；灌流15～30 min，用BL-420F生物机能实验系统监测心率(HR)、左室发展压(LVDP)等指标，待心脏搏动达稳定状态后，停止灌流30 min，使心脏缺氧，然后恢复灌流30 min，使心肌产生再灌注损伤。

2.2 离体心脏MIRI实验动物分组

SD大鼠80只，随机分为11组，每组7～8只。模型组：按2.1项下方法，稳定灌流15 min后，全心停灌30 min，再灌流30 min；木樨草素、山奈酚、木樨草苷各剂量组：同模型组，分别用含木樨草素、山奈酚、木樨草苷100 μmol/L的Locke-Ringer's液通过恒流(0.1、0.2、0.5 mL/min)灌流10 min，停灌30 min，再含药灌流30 min；阳性药(雷米普利)组：同模型组，含雷米普利100 μmol/L的Locke-Ringer's液通过恒流(0.2 mL/min)灌流10 min，停灌30 min，再含药灌流30 min。

2.3 HR、LVDP、左室舒张末压(LVEDP)、冠脉流量(CF)差测定

根据实验系统记录表实时读取HR、LVEDP、LVDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)。CF测定：缺血前5 min和复灌后10 min分别收集1 min灌流液，量取体积。CF差=CF缺血前-CF复灌后。

2.4 乳酸脱氢酶(LDH)测定

再灌注15 min末取1 mL灌流液冻存备用，测定LDH，检测按LDH测定试剂盒说明书制备反应液，于440 nm处测定OD。

2.5 测定心肌梗死面积

离体心脏再灌注30 min后，取下心脏立即冻存，自心脏纵轴垂直切成2 mm均匀薄片，共5片，用1% TTC在37 ℃下染色15 min，弃去染色液，生理盐水冲洗，取出吸去水分拍照。根据颜色不同区分各区域(鲜红色为危险区，苍白色或粉红色为梗死区)，称定总质量后将梗死区分离称质量，计算其占总心脏比值。

2.6 11β-HSD1活性水平测定

2.6.1 细胞培养、建模与给药 LO2细胞置于CO2培养箱(37℃，5% CO2)中正常培养，将处于对数生长期的细胞分组后分别加入药物：空白组加无血清DMEM培养基；给药组分别加入木樨草素、山奈酚、木樨草苷、甘草酸单铵盐于培养基中(终浓度为10 μmol/L)；24 h后，吸弃各组上清液，分别按下列方式加液：空白组加无血清无酚红DMEM培养基；给药组分别加可的松(终浓度为50 nmol/L)和NADPH(终浓度为1.2 mmol/L)，并加无血清无酚红DMEM培养基；模型组同给药组。培养1 h后，取上清备测。

2.6.2 检测方法 按皮质醇ELISA试剂盒说明书操作，用酶标仪在450 nm测定OD。

2.7 LPAATβ检测

2.7.1 内质网分离 取ICR小鼠肝脏2 g置预冷离心管中，加入GENMED清理液洗涤1次，切碎组织，再加入预冷GENMED裂解工作液匀浆，然后将匀浆液移入离心管中4 ℃离心，10 min，1 000×g，吸取上清液至离心管中，4 ℃离心15 min，12 000×g，吸取上清液至离心管中，4 ℃离心60 min，100 000×g，弃上清液，保留沉淀，加入500 mL GENMED保存液，充分混匀，放入-70 ℃冰箱备用。

2.7.2 LPAATβ ELISA法检测模型建立 将分离的样品稀释成适宜的浓度，加入酶标板中，每孔100 μL，在4 ℃下包被12 h，然后用PBST溶液洗板3次。每孔加入10%小牛血清100 μL，37 ℃温育2 h，然后用PBST溶液洗板3次。每孔100 μL加入用1%NBS稀释LPAATβ一抗，37 ℃温育2 h，然后用PBST溶液洗板3次。每孔100 μL加入用1%NBS稀释的二抗，37 ℃孵育1 h然后用PBST溶液洗板5次。每孔90 μL加入TMB底物。室温避光孵育，5～10 min后每孔加入50 μL 2.5 mol/L硫酸终止反应。在450 nm处测量OD(酶标仪)。

2.7.3 药物活性测定 在封闭后加一抗前分别加入100 μL木樨草素、山奈酚、木樨草苷(终浓度为10 μmol/L)，对照组用100 μL PBS代替，37 ℃孵育2 h。

2.8 PTEN活性检测

根据PTEN试剂盒操作规程，将PTEN与木樨草素、山奈酚、木樨草苷(终浓度100 nmol/L)在37 ℃预孵育，5 min后加入3 nmol/L PI P3继续孵育，30 min后加入0.8体积孔雀绿试剂停止反应，然后在625 nm处测定OD，PTEN活性以生成的H3PO4水平反映。

2.9 SHP-2活性测定

加35 μL检测缓冲液(119.15 mg HEPES，7.444 8 mg EDTA，4.626 mg DTT，58.44 mg NaCl依次溶解于9 mL三蒸水中，调节pH值为7.4，定容至10 mL)于96孔板，再加10 μL供试药溶液(终浓度均为10 μmol/L)，预热至30 ℃，然后加5 μL SHP-2到检测缓冲液与供试药混合液中(空白孔不加)，静置10 min，再加入50 μL pNPP储备液，充分混匀(pNPP终浓度为50 mmol/L)，最后于405 nm进行动态测定硝基苯酚的OD。

2.10 统计学方法

3 结果

3.1 木樨草素、山奈酚和木樨草苷对HR、LVEDP、LVDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影响

3.1.1 木樨草素对HR、LVEDP、LVDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影响 图1～2显示，各组给药后和未处理时相比，各参数未发生显著性改变，但缺血/再灌注(I/R)后，与缺血前比较，模型组HR显著升高，LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)显著降低(P<0.05～0.01)，木樨草素各剂量组(1、2、5 μmol/L)和阳性对照药雷米普利组HR升高不显著，LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)有一定程度降低，与模型组比较，有显著性差异(P<0.05)，并显示一定的量效关系，表明木樨草素具有一定的保护MIRI的作用。

3.1.2 山奈酚对HR、LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影响 图2～3显示，各组给药后和未处理时相比，各参数未发生显著性改变，但I/R后，与缺血前比较，模型组和阳性对照药雷米普利组对HR、LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影响同前，山奈酚各剂量组(1、2、5 μmol/L)HR升高不显著，LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)有一定程度降低，与模型组比较，有显著性差异(P<0.05)，并显示一定剂量依赖关系，表明山奈酚具有一定的保护MIRI的作用。

3.1.3 木樨草苷对HR、LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影响 图2和图4显示，各组给药后和未处理时相比，各参数未发生显著性改变，但I/R后，与缺血前比较，模型组和阳性对照药雷米普利组对HR、LVDP、LVEDP和(-dp/dt)/(+dp/dt)的影响同前，木樨草苷中、高剂量组(2、5 μmol/L)HR升高不显著，LVDP和LVEDP降低不显著，3个剂量组(-dp/dt)/(+dp/dt)均一定程度降低，与模型组比较，有显著性差异(P<0.05)，并显示一定剂量依赖关系，表明木樨草苷具有一定的保护MIRI的作用。

3.2 木樨草素、山奈酚和木樨草苷对CF差、LDH和梗死区比重的影响

表1显示，与正常组比较，模型组CF差、LDH释放量和梗死区比重显著升高(P<0.01)；与模型组比较，阳性对照药雷米普利、木樨草素、山奈酚和木樨草苷3个剂量组(1、2、5 μmol/L)均显著降低CF差、LDH释放量和梗死区比重(P<0.05)，并显示一定的剂量依赖关系。表明3个黄酮化合物通过保护心肌梗死和细胞破坏发挥保护MIRI的作用。

表1 木樨草素、山奈酚和木樨草苷对CF差、LDH和梗死区比重的影响

注：与正常组比较，##P<0.01;与模型组比较，*P<0.05,**P<0.01。

3.3 木樨草素、山奈酚、木樨草苷对11β-HSD1的抑制作用

图5显示，与正常组相比，模型组氢化可的松含量显著升高(P<0.01)，表明11β-HSD1具有很强的活性。给药预处理后，与模型组比较，木樨草素、山奈酚、木樨草苷及阳性对照药甘草酸单铵盐组氢化可的松含量均显著降低(P<0.05)，表明11β-HSD1活性受到了抑制。

3.4 木樨草素、山奈酚、木樨草苷对LPAATβ的抑制作用

LPAATβ活性抑制作用结果显示，木樨草素、山奈酚、木樨草苷作用显著(P<0.05)，最高抑制率达32.9%。见图6。

3.5 木樨草素、山奈酚、木樨草苷对PTEN活性抑制作用

图7显示，与正常组比较，加入药物预处理后，木樨草素、山奈酚、木樨草苷及阳性对照药bpv(phen)能显著抑制PTEN的活性(P<0.01)，其中山奈酚抑制作用最强。

3.6 木樨草素、山奈酚、木樨草苷对SHP-2活性抑制作用

图8A显示，在1～16 min检测时间内，木樨草素、山奈酚、木樨草苷和阳性对照药NSC-87877对SHP-2活性均有抑制作用；以4 min为对比时间点，与正常组比较有显著性差异(P<0.05)，但3个化合物抑制作用强度无明显差异(图8B)。

4 讨论

木樨草素、山奈酚和木樨草苷均可减轻MIRI后心肌梗死面积，改善CF，减少心肌标志酶LDH的漏出，改善灌注后左心室收缩功能，并显示一定的量效关系，表明3个化合物具有保护MIRI的作用，且通过对比发现3个化合物作用强度相当。

11β-HSD1主要在肝脏、骨骼肌、脂肪等组织中表达，是一种依赖NADP(H)的还原酶。因此本研究选择正常肝细胞LO2细胞，以可的松为底物，甘草酸为11β-HSD1抑制剂，建立药物筛选模型。木樨草素、山萘酚、木樨草苷均能显著抑制催化糖皮质激素代谢的11β-HSD1，避免发生胰岛素抵抗，从而预防高血压、动脉粥样硬化等代谢综合征的发生，进而预防缺血性心肌病的发生或有助于MIRI的治疗，其中山奈酚作用最强。

由于LPAATβ具有组织表达特异性，本研究从小鼠肝脏组织(或肝脏内质网)中提取获得LPAATβ，再建立ELISA模型。由于尚无明确效果的LPAATβ的抑制剂，故未设阳性对照组。研究结果显示，木樨草素、山奈酚、木樨草苷对LPAATβ具有良好的抑制作用，表明3个化合物能提高LPA的含量，从而间接发挥在防治卒中或心肌梗死等疾病中的作用，同时表明LPAATβ在心肌缺血中的作用值得研究。

在许多细胞中PTEN是潜在的PI3K活性负调节因子[23]，抑制PTEN是诱导保护MIRI的潜在靶点。动物实验研究表明，抑制PTEN在MIRI后的心肌存活中具有治疗作用[12]。本研究发现木樨草素、山奈酚、木樨草苷对PTEN活性均有显著性抑制作用，与阳性对照药bpV(pic)作用强度相当，表明木樨草素、山奈酚、木樨草苷保护MIRI可能与其抑制PTEN靶点相关。当然，木樨草素、山奈酚、木樨草苷在体内对PTEN活性是否具有相同或相当的抑制作用，有待进一步研究。

SHP-2是细胞信号转导的酪氨酸激酶途径中的信号分子，当前国内外对其正常生理作用的研究较多，但其表达异常与疾病的关系报道较少[24]。本研究结果显示，木樨草素、山奈酚、木樨草苷对SHP-2活性均有抑制作用。

木樨草素、山奈酚、木樨草苷均为黄酮类化合物，在多种中药、蔬菜和水果中均有分布。中药与天然药物中含有多种有效成分，它们通常共同发挥药效作用。中药与天然药物中的多成分、多靶点之间的协同作用特点是中药药理机制研究中的重要层面。中药有效成分的多样性可契合生物多靶，而生物靶标间的协同作用是中药药效机制的重要补充。一些多成分、多靶点药物对于复杂疾病起到了很好的治疗效果，是对经典的“一药一靶”药物发现理念的有效补充。本研究旨在考察3种黄酮类成分——木樨草素、山奈酚、木樨草苷对MIRI的保护作用及其降脂和抗凋亡作用机制，期望为中药“多成分、多靶点”作用模式研究提供实例支持，为全面防治MIRI提供依据。