类胰岛素性腺激素调控对虾性腺分化的研究进展

任晋东，牛宝龙*，杨卫明，楼宝*

(1.浙江省农业科学院 水生生物研究所，浙江 杭州 310021； 2.海盐县水产技术推广站，浙江 嘉兴 314300)

我国是对虾养殖大国。据统计，世界具有商业价值或潜在商业价值的虾有300多种，我国近海对虾种类达100多种[1]，主要养殖类别包括凡纳滨对虾、中国对虾、长毛对虾、斑节对虾、日本对虾、墨古对虾等，以及由此培育的新品种。随着虾苗种质资源退化和病害频发等问题，我国对虾养殖业受到巨大影响[2]。由于对虾雌雄之间的某些生物学或经济学性状(生长速度、个体大小等)存在显著差异，且性成熟后个体大小相差悬殊，如果实现单性化养殖，则可以缩短养殖周期，提高产量。

类胰岛素性腺激素(insulin-like androgenic gland hormone，IAG)是甲壳类动物雄性个体性腺分化和维持性别特征的控制因子，其在雄性甲壳类动物性腺中的表达情况决定着雄性个体性腺的分化发育方向。IAG在对虾性腺分化中调控分子机理的研究对于揭示对虾性腺发育分化机理、提高对虾生产效率和开发高产单性对虾群体或配体套系具有重要的理论指导意义，并为开发更为便捷的对虾性别逆转方法提供理论基础。

本文就对虾性腺结构与作用、IAG介导对虾性别控制、IAG与对虾性腺分化作用、IAG调控对虾性别控制机制的难点，以及以IAG为关键因子进行对虾单性繁育群体构建的可行性措施进行综述，旨在为对虾单性繁育技术研究提供参考。

1 对虾性腺结构特征

对虾属于节肢动物门、甲壳纲、十足目、对虾科，可分为淡水类和海水类。雌性对虾生殖系统主要包括卵巢及输卵管等，输卵管位于卵巢两侧，呈透明状[3]；雄性对虾生殖系统主要包括精巢、输精管和精囊荚，精荚囊末端附着有促雄性腺(图1)。研究发现，凡纳滨对虾促雄性腺位于精荚囊的壶腹部，呈不规则块状结构(图2)[4]。1962年，Charniaux-Cotton研究发现促雄性腺与甲壳动物雄性分化和发育相关[5]；1999年，Khalaila等[6]发现促雄性腺素(insulin-like androgenic gland hormone，IAG)在沼虾性腺分化中起决定性作用，至此揭开研究人员对IAG和甲壳类动物促雄性腺体主要功能的初步认识和了解。

A—雌性对虾；B—雄性对虾。图1 脊尾白虾性腺的结构解剖

A—促雄性腺的外部形态；B—放大20倍的促雄性腺。SV—精荚囊；AG—促雄性腺。图2 对虾促雄性腺体的解剖结构

甲壳动物的促雄性腺常位于第五对步足基部，多数位于输精管近末端[7]。厚纹蟹(Pachygrapsuscrassipes)促雄性腺呈索状[8]，缠绕在输精管上，切面直径30～50 μm，某些部位促雄性腺细胞聚集成团，腺体包被一层很薄的鞘膜，细胞质比较均匀，细胞核呈卵圆形，最大细胞直径达8～10 μm[9]。中国明对虾(Fenneropenaeuschinensis)与克氏原螯虾(Procambarusclarkii)细胞类型相似[10]，呈葡萄串状，由长椭圆形和球形这2种细胞组成。凡纳滨对虾促雄性腺呈不规则的块状，通过结缔组织与精荚囊相连，在不同的发育时期其结构和细胞类型会发生一定变化。

促雄性腺是雄性甲壳动物特有的内分泌器官，也是分泌IAG的唯一性腺体[11-12]。IAG分子由2条肽链组成，中间由2个二硫键连接，结构与胰岛素家族类似，因此，又被称为类胰岛素性腺激素[13]。研究发现，促雄性腺不仅在雄性性别发育分化中具有一定的作用，而且在鳌虾生长发育中也具有一定的功能[14]。Tekitek等[15]发现，甲壳类动物促雄性腺在性腺发育成熟的过程中存在高水平的甲基化酶表达，而DNA甲基化对于细胞分化过程中多个基因座大规模改变产生作用[16]，表明雌雄个体IAG差异表达与上游的甲基化调控存在一定关联。然而，IAG在促雄性腺体发育分化中是否受到DNA甲基化酶的调控尚不明确，尤其是在IAG不表达的情况下，其诱导的性腺逆转分化调控分子机制还有待于进一步研究。

2 IAG结构特征与特性

IAG是甲壳类动物雄性个体性腺分化和维持性别特征的控制因子，由雄性个体的性腺体分泌，并且决定了雄性个体的性特征[17-18]。在缺乏IAG的情况下，雄性个体会出现性逆转，表现出雌性继发性特征和卵黄发生；将能够分泌IAG的AG细胞悬液植入未成熟雌性个体中，导致雌性个体性逆转和卵黄发生停止[19]。由于IAG在雄性甲壳类动物性腺中的表达情况决定着雄性个体性腺的分化发育方向(图3)，常用其作用于甲壳类动物，以构建单性繁殖群体，培育高产的甲壳类动物优势种群或新品种。

图3 IAG对甲壳类动物雄性个体性别的控制机理

已有甲壳类动物性别控制方法较多，Levy等[20]利用性腺细胞移植进行罗氏沼虾雄性个体性别翻转，Sellars等[21]利用三倍体诱导进行对虾性别控制，Lezer等[19]利用RNA干扰表达技术进行IAG基因表达控制，从而调控甲壳类动物性腺分化。水产动物性腺分化较复杂[22]，而IAG对于甲壳类动物性腺分化控制的高效性，决定了IAG在调控甲壳类动物性腺分化机制中的关键性作用。IAG主要通过性腺激素调控轴和神经递质传递调控轴2种途径进行性别控制。性腺激素调控途径中，性腺刺激激素、IAG和性腺抑制激素发挥关键作用；在神经递质调控途径中，仅有性腺抑制基因存在关键调控作用。IAG的表达对性腺抑制激素基因的表达有影响，但IAG调控的下游转录因子有哪些，这些调控因子如何控制性腺分化，以及IAG基因自身表达调控的分子机制尚处于探索阶段。

3 IAG介导的对虾性别控制

IAG是维持甲壳动物雄性个体性腺分化发生的唯一确定的关键因子，其自身表达也具有显著的时空特征[23-24]，IAG具有调控雄性分化、维持雄性第二性征的功能，可抑制甲壳动物的卵巢发育[25]。IAG不表达的情况下，雄性个体保持雌性个体特征，分化形成雌性生殖腺，产生成熟的卵子[19]。

Ventura等[26]通过RNAi对罗氏沼虾雄性个体IAG基因进行沉默表达研究，发现其在甲壳类动物性腺逆转分化过程中产生作用。在罗氏沼虾幼虫阶段后期注射双链的IAG干扰表达序列，罗氏沼虾逆转成全雌性表征个体，并具有完整的雌性罗氏沼虾繁殖生殖系统[27]。利用IAG干扰表达和两阶段式的生产繁育方式，可以大范围培育全雄性个体的繁育生产群体，是甲壳类动物单性繁殖的研究热点[20，28]。两阶段式生产方式指通过注射双链的IAG干扰表达RNA序列获得假雌性个体，然后利用假雌性个体与真雄性个体繁殖生产，孵化获得全雄性个体的生产群体。同时基于IAG的RNAi干扰技术，研究获得了甲壳类动物早期性别鉴定的高效生物标记[29]。已有研究发现IAG在甲壳类动物性别控制中的关键作用，但对于IAG调控甲壳类水产动物性腺逆转分化和生殖系统表观遗传特征的生物信号通路仍未知，其分子机制有待进一步研究。

4 IAG与对虾性腺分化

甲壳类动物中雄性个体的性腺分化受到雄激素腺体控制[5]，雄激素腺体是甲壳动物雄性个体性器官发育成熟过程中最重要的参与者[30]。雄激素腺体不仅能够在甲壳动物雄性遗传基础上发挥雄性化的调控作用，也可以令雌性个体在原有遗传基础上逆转形成雄性生殖腺体，并产生相似的雄性生殖特性[31]。当雄性甲壳类个体摘除雄激素腺体后，雄性个体能够表现出雌性个体的繁殖特征[32]。Manor等[30]研究发现，IAG是由雄激素腺体分泌的性别控制关键因子，是雄激素腺体发挥功能的关键分子。在双链核糖核酸注射沉默IAG编码基因的情况下，会导致甲壳虾类动物雄性个体的性腺逆转分化[19]。

尽管IAG基因在雌雄个体基因组中都有发现，但最初研究人员一直认为其仅在雄激素腺体中表达。IAG不仅具有诱导雄性个体性腺分化的作用，还具有刺激雌性个体生长和性器官发育的功能[25，33]。虽然IAG在孤雌生殖的十足目物种中也有表达[20]，但由于研究技术局限，还未探明其调控机制。随着单细胞转录组测序技术的成熟和凡纳滨对虾基因组的成功破译，为深入探索对虾性腺分化分子机理提供了必要的系统资源[34]。已有研究通过单细胞转录组测序技术完成首个哺乳动物的细胞转录图谱，为进一步揭示其他物种不同细胞转录调控通路提供了很好的技术借鉴[35]，也为进一步挖掘IAG的系统调控网络图谱提供了方法工具。

5 利用IAG构建单性对虾繁育群体的难点

虽然IAG作为一种有效的水产动物性别逆转关键因子，但将其应用于对虾单性繁育存在以下难点。一是对虾性腺分化关键期较难确定。对虾的发育包括幼体、康虾、籽虾、成虾等阶段，在性别分化时间上存在很大的差异。杨炎等[36]研究发现，米虾的雌雄个体性腺分化阶段存在时间差异，雌性个体的卵巢从孵化后第10天开始分化，形成早期的卵原细胞，而雄性个体精巢分化要早于雌个体。与米虾相比，罗氏沼虾的性腺分化阶段相对较晚，罗氏沼虾体长达到3～5 cm时还处于分化中[37]。海水类对虾的性腺分化更加复杂，其分化过程易受到温度、盐度等因素影响[38]。对虾性腺分化时体长仅为1 cm左右，很难进行生物技术干扰等操作，因此，对虾实现性逆转或单性养殖的难度较大。二是性染色体类型具有不确定性。对虾染色体数量和类型具有多样性[39]，已有研究通过人工染色体库技术构建了罗氏沼虾“ZW”类型表达基因库[40]，但IAG基因是否位于性染色体或是常染色体上仍未知。三是性别分化的分子机制尚未明确。虽然IAG基因的表达对性腺抑制激素基因的表达有影响，但是IAG调控的下游转录因子有哪些、这些调控因子如何控制性腺分化，以及IAG基因自身表达调控的分子机制尚处于未知阶段，这也给进一步利用IAG调控通路进行单性繁育群体构建提出了挑战。

6 对虾单性繁育技术研究策略

基于对虾单性繁育技术的难点，可以针对性的利用成熟的生物基因组重测序技术，探明IAG表达的上游调控机制，以及Microwell-Seq技术和生物信息学方法找到对虾性腺分化的起始关键时间点，利用IAG干扰后的假雌性和真雄性个体性腺分化前后的差异表达基因，预测特异性的IAG靶向调控基因，并进行体外验证，最终阐明IAG在对虾性腺分化控制中的分子机理，实现对虾高产单性群体的培育。具体做法包括以下几个方面。

对虾性别分化关键时间点的研究。利用Microwell-seq测序分析和生物信息学手段分析孵化30～60 d对虾性腺的差异基因表达谱，以IAG的表达时序为参考对象，找到对虾性腺分化的关键起始点，构建以IAG沉默为基础的性别逆转假雌个体，并与野生型雄性个体的杂交，研究后代IAG的随性别变化情况，分析沉默IAG的伴性遗传特点，确定对虾性染色体类型及IAG位置，为后期进行对虾单性繁育群组建奠定基础。

雌雄个体基因组差异比较。利用对虾早期性别鉴定，收集鉴定后的雌雄腺体生殖细胞，构建雌雄个体IAG全基因组结构图谱，分析雌雄个体IAG基因调控关键区域的甲基化差异，分析甲基化与IAG基因表达的对应关系，并对IAG基因的全长、5′和3′侧翼序列的差异进行比较，获得雌雄个体性腺分化的遗传基础差异及IAG基因结构差异，形成IAG基因表达上游调控通路结构图。

IAG调控基因下游网络分析。利用干扰技术收集假雌和真雄个体雄激素腺体细胞，开展Microwell-seq测序分析，利用生物信息学手段筛选干扰雄激素腺体细胞和野生型雄激素腺体细胞之间的差异基因表达谱，预测差异基因间的靶向调控关系，并对其中的差异表达转录因子与差异的甲基化位点进行表达谱分析，绘制IAG与差异转录因子和差异甲基化位点之间的网络互作关系，并进行关系验证。

利用以上研究，找出最佳的对虾性腺分化逆转通路，形成凡纳滨对虾的全雌或全雄繁育体系，培育高产的单性繁殖群体或品种，也为其他甲壳类动物全雌或全雄群体构建提供理论依据。