环状RNA-42398通过调控TGF-β1/Smads信号通路抑制肝星状细胞活化*

周玉平，吕雪幼，杨 萍 ，温晋锋，王庆领，叶国良

（宁波大学 1医学院附属医院，2消化疾病研究所，浙江宁波315020；3宁波卫生职业技术学院，浙江宁波315100；4宁波大学医学院，浙江宁波315211）

环状 RNA（circular RNA，circRNA）是非编码RNA研究领域的最新焦点之一，在阐明疾病发病机制及相关的诊断标志物及治疗靶点方面，取得了重大进展［1］。本课题组通过基因芯片技术初步分析了肝纤维化模型小鼠肝脏的circRNA表达谱变化，显示mmu_circ_42398的表达变化差异最大（模型组比正常组降低了11.74倍），此外，在小鼠肝星状细胞（hepatic stellate cells，HSC）活化模型中，mmu-circ-42398表达也显著降低的［2］。本研究拟在此基础上，围绕肝星状细胞活化这一肝纤维化最核心的细胞生物学事件，探讨mmu_circ_42398对HSC活化的影响，并初步探讨其可能的细胞内信号转导机制。

材料和方法

1 材料和主要试剂

JS1小鼠肝星状细胞株购自深圳豪地华拓生物公司。胎牛血清和细胞培养液购自Gibco；TRIzol购自Invitrogen；逆转录试剂盒GoScript™Reverse Transcription Systemt和实时荧光定量PCR试剂盒GoTaq®qPCR Master Mix购自Promega；mmu_circ_42398过表达质粒和对照空载质粒由广州吉赛生物科技公司提供；Lipofectamine 2000转染试剂盒购自Invitrogen；RIPA裂解液购自碧云天生物技术研究所；Protease Inhibitor Cocktail和Phosphatase Inhibitor Cocktail购自Selleck。BCA蛋白定量试剂盒购自Thermo；α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）、I型胶原（collagen type I，Col I）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）抗体购自Proteintech；转化生长因子β1（transforming growth factor-β1，TGF-β1）、Smad2、Smad3、p-Smad2和p-Smad3抗体购自Abcam。PCR及测序用小鼠引物由上海英骏生物技术有限公司合成，序列见表1。

表1 引物序列Table 1.The sequences of the primers

2 实验方法

2.1 JS1细胞培养和实验分组 JS1细胞用10%FBS-DMEM培养液，置于37℃、5%CO2的培养箱中培养。细胞培养至80%融合度传代接种。细胞实验时分成3组：正常对照组（control组）、空载体阴性对照组（vector组）和mmu_circ_42398过表达组（mmu_circ_42398组）。

2.2 过表达载体转染JS1细胞 转染前24 h，5×105个细胞接种在6孔板上，加入2 mL完全培养液培养，转染前细胞汇合达到70%～90%。在100 μL无血清培养液加入3 μg质粒，柔和混匀。混匀Lipofectamine 2000试剂，用100 μL无血清培养液稀释4 μL Lipofectamine 2000试剂，轻轻混匀，室温放置5 min。将稀释好的质粒和Lipofectamine 2000试剂混合，轻柔混匀，室温放置20 min。将200 μL质粒-Lipofectamine 2000复合物加到含800 μL无血清培养液的细胞孔中，来回轻柔摇晃细胞培养板。细胞在37℃，5%CO2培养箱中，培养5～6 h后吸去转染培养液，更换完全培养液。48 h后收集细胞。

2.3 RT-qPCR验证mmu_circ_42398过表达 提取细胞样品总RNA，逆转录后进行qPCR检测，分别以GAPDH和mmu_circ_42398特异引物进行qPCR。PCR扩增反应体系为20 μL，条件设置为：95℃ 10 min；95℃10 s，60℃ 60 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。同时设计测序引物，PCR后回收条带测序验证环化位点接头。每次设3个复孔，重复3次独立实验。

2.4 Western blot检测蛋白表达 提取JS1细胞蛋白，BCA法定量，与SDS上样缓冲液混合，95℃变性5 min。制胶，上样，电泳，切胶，半干转法转PVDF膜。PBST洗膜3次，每次10 min，以5%BSA/PBS封闭1 h，加I抗（α-SMA、Col I、TGF-β1、Smad2、Smad3、p-Smad2、p-Smad3及 GAPDH），4℃轻摇孵育过夜，PBST洗膜3次，每次10 min，加II抗（1∶5 000稀释），室温轻摇孵育1 h。进行ECL化学发光显影，获取条带后ImageJ软件分析灰度值，以GAPDH为内参照计算蛋白相对表达量。细胞实验每次设3个复孔，重复3次独立实验。

3 统计学处理

采用SPSS 20.0软件进行分析。数据以均数±标准差（mean±SD）表示，两组间比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05表示差异有统计学意义。

结 果

1 mmu_circ_42398过表达载体转染效果观察

细胞转染48 h后，荧光倒置显微镜下观察，vector组和mmu_circ_42398过表达组见大部分JS1细胞内有绿色荧光表达，两组细胞形态无明显异常，细胞转染率达80%以上，见图1。

Figure 1.The JS1 cell transfection rate 48 h after transfection（scale bar=200 μm）.Most of JS1 cells had green fluorescent protein expression.图1 荧光显微镜观察mmu_circ_42398过表达载体的转染效果

2 mmu_circ_42398过表达效果验证

RT-qPCR检测结果显示，mmu-circ-42398过表达组mmu_circ_42398的表达较vector组显著增加（P＜0.01），见图2A。将PCR产物进行一代测序，确定其环化位点（backsplice site），并将其序列信息与数据库circBase中的序列信息对比，结果一致，见图2B。这一结果证明该cicrRNA确实为环状RNA结构，而非线性RNA结构。

Figure 2.Verification of mmu_circ_42398 over expression.A：mmu_circ_42398 expression in JS1 cells was detected by RT-qPCR；B：the backsplice site of PCR products was verified by sequencing，and compared with that of circBase database.Mean±SD.n=3.##P＜0.01 vs vector group.图2 mmu_circ_42398的鉴定及过表达效果的验证

3 mmu_circ_42398过表达抑制JS1细胞的活化

Western blot结果显示，mmu_circ_42398过表达组的α-SMA及Col I的蛋白表达较vector组显著降低（P＜0.01），见图3。

4 mmu_circ_42398过表达对TGF-β1/Smads信号通路的影响

Western blot结果显示，与vector组比较，mmu_circ_42398过表达组的p-Smad2和p-Smad3蛋白水平显著降低（P＜0.01），TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表达量无显著变化，见图4。

讨 论

肝纤维化是各种慢性肝病向肝硬化、肝癌、肝衰竭方向发展的共同病理阶段，一直是肝病研究的重点领域。HSC的活化是促进肝纤维化持续发展的重要因素［3］，抑制HSC的活化被认为是抗肝纤维化的有效途径［4］。TGF-β1/Smads信号通路在HSC的激活、组织纤维化发生、发展过程中起到了关键性作用［5］。当TGF-β1与其位于HSC胞膜的受体（TGF-β1 receptor，TβR）结合并使TβR活化，与TβR结合的RSmads（包括Smad2和Smad3）就会被磷酸化而激活，Smad2/3是TβR-I受体的特异性信号转导蛋白，磷酸化的R-Smads与Smad4形成多聚复合物，穿过核膜进入细胞核，在其他转录因子的协同下，参与不同目标基因的转录［6］，Smad7是该信号通路中最重要的负反馈调节蛋白［7］。调控TGF-β1/Smads信号通路被认为是干预HSC活化和肝纤维化的重要策略。

circRNA是当前非编码RNA研究领域的热点，最近的两项研究报道显示，circRNA可能影响HSC的活化：Chen等［8］分析了放射线诱导的人肝星状细胞株LX-2活化模型的circRNA差异表达谱，并进一步证实了hsa_circ_0071410可通过“miRNA海绵作用”结合miR-9-5p，从而影响HSC的活化；Wang等［9］的研究显示患者血清CircMTO1表达水平与肝纤维化疾病进展显著负相关，通过体外细胞模型进一步证实了CircMTO1可通过结合miR-17-5p，提高Smad7的表达水平，从而抑制肝纤维化进展。本课题组前期通过小鼠肝纤维化模型和肝细胞株JS1体外活化模型，筛选出mmu_circ_42398可能影响肝星状细胞的活化。本研究通过构建mmu_circ_42398过表达质粒，并将其转染到JS1细胞中，观察到星状细胞活化标志物即α-SMA及Col I蛋白表达显著减少，说明mmu_circ_42398过表达能显著抑制HSC的活化。课题组进一步从TGF-β1/Smads信号通路的角度探讨了其可能的机制，结果显示，mmu_circ_42398过表达组JS1细胞中p-Smad2和p-Smad3蛋白水平显著降低，但TGF-β1、Smad2和Smad3蛋白表达量无显著变化。上述结果提示，mmu_circ_42398过表达能显著抑制R-Smads的磷酸化，从而抑制细胞内TGF-β1/Smads信号通路的转导，这是其抑制HSC活化的作用机制之一。

此前，我们通过生物信息学分析，显示mmu_circ_42398表面存在miR-338-3p的反应元件（microRNA response element，MRE），能特异性结合miR-338-3p［10］。最近的一项双萤光素酶报告基因实验显示miR-338-3p能直接与骨成形蛋白-激活素膜结合阻断因子（BMP and activin membrane-bound inhibitor，BAMBI）结合，降低 BAMBI活性，从而激活TGF-β/Smads信号通路［11］。BAMBI是 TGF-β/Smads信号转导通路的伪受体，与TGF-βⅠ型受体结构相似，但不具有同样的活性，它可以竞争性地与TGF-βⅡ型受体结合，BAMBI由于缺乏胞内区的丝氨酸/苏氨酸激酶结构域而不能磷酸化，导致胞质区的Smad蛋白无法被磷酸化激活，从而阻断TGF-β家族的信号转导［12］。本实验观察到，mmu_circ_42398的过表达对TGF-β1本身表达并无影响，仅是降低了Smads蛋白的磷酸化水平，上述结果提示，mmu_circ_42398可能通过“miRNA海绵作用”靶向结合miR-338-3p，提高了BAMBI表达水平，从而进一步抑制Smads蛋白的磷酸化水平，最终抑制了HSC的活化。