MicroRNA-145在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌侵袭转移的影响研究

张志强 郑 爽 马 怡 王梓瑛 王晓舟 赫丽杰

（辽宁省人民医院（中国医科大学人民医院）肿瘤一科，辽宁 沈阳 110016）

随着我国对妇科疾病的预防和控制越来越重视，加强对恶性妇科疾病的筛查和尽早治疗。乳腺癌作为发生在乳腺腺上皮组织的恶性肿瘤，在女性群体发生率较高，且全球发病率均较高，呈现逐渐上升趋势，因此需加强对其的防范和有效治疗[1-3]。根据临床研究可知，乳腺癌转移会导致患者死亡的主要原因，而在肿瘤发生发展中miR-145参与度较高，且其在一些肿瘤中具有抑癌基因作用，因此需加强对其的研究，以其为可靠方案提供契机[4-6]。为此，本次研究对miR-145在乳腺癌中的表达及其对乳腺癌侵袭转移的影响进行了探讨，并选择2016年7月至2018年7月辽宁省人民医院确诊的乳腺癌患者48例作为研究资料，报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料：选择2016年7月至2018年7月辽宁省人民医院确诊的乳腺癌患者48例作为研究资料，均为女性，年龄在32～75岁，平均年龄为（51.05±3.16）岁，排除化疗、免疫或放射等抗肿瘤治疗患者。患者均知晓本次研究内容及目的，且自愿签署知情同意书，并获得医院伦理委员会批准。

1.2 检测方法：取术中癌组织及相应癌旁组织作为标本，经分离处理，置于液氮速冻后，置入-80 ℃冰箱内储存，选择美国Gibco公司生产的DMEM培养基（HEK293T各HBL-100）、RPMI1640培养基（MCF-7各MDA-MB-468），L15培养基（MDA-MB-231），McCOY'S5A培养基（SK-BR-3）等，选择美国Bio-Rad公司生产CFX96实时荧光定量PCR仪进行检测。先进行细胞培养，所有培养基中均加入10%胎牛血清（美国Gibco公司），1%双抗，均置入37 ℃培养箱中，5%CO2。取1 μg总RNA与1 μL逆转录酶，3 μL逆转录引物混合后在15 μL反应体系中进行转录，取1.33 μL逆转录产物cDNA与TaqMan 1 μL引物混合，在15 μL反应体系中40个循环，将U6作为对照，检测miR-145的表达。利用划痕实验进行细胞迁移能力检测，将对数生长期的SK-BR-3细胞铺板，当细胞达到50%～70%融合后，依据说明将pSIF-miR-145质粒与pSIF空白质粒转染至细胞，48 h后，利用灭菌枪头划痕，再利用PBS洗涤，将划下的细胞去除，选择无血清培养基培养，间隔24 h取样，采用Transwell检测细胞侵袭能力，在显微镜下取5个视野计算细胞计数。可能靶基因预测可采用TargetScan、PicTar和miRanda数据库分析，构建ANGPT2 3'UTA端片段，将结合位点突变掉（GGGGGGG）的片段，将pGl3作为对照组，pSIF空白质粒转染至HEK293T细胞，24 h裂解细胞分析结果。提取RIPA裂解细胞蛋白并测定浓度，每孔50 μg，分离后，电转移至PVDF膜，二抗孵育、洗涤，最后扫描结果。

1.3 统计学处理：利用统计学软件IBM SPSS Statistics 19对进行分析，计量资料以均数±标准差（）表示，采用t检验，计数资料以百分数（%）表示，采用卡方检验，统计值有统计学差异为P＜0.05。

2 结果

2.1 乳腺癌组织及细胞中miR-145的表达：经实时FQ-PCR检测乳腺癌组织和癌旁组织中miR-145的相对表达量分别为（49.85±21.02）、（185.04±42.64）；实时FQ-PCR检测对数生长期乳癌细胞系的miR-145表达，MCF-7为（0.50±0.04）、MDA-MB-231（0.06±0.01）、MDA-MB-468（0.35±0.03）、SK-B-3（0.04±0.01），均偏低，呈现为低表达。

2.2 miR-145对乳腺癌侵袭转移的影响：转染pSIF-miR-145质粒48h后，SK-BR-3细胞miR-145的表达量与阴性对照相比增高了445.42倍；观察图1可发现，划痕实验24h后转染pSIF-miR-145质粒细胞化和愈合速度较低，侵袭实验显示，转染pSIF-miR-145质粒后穿过基质胶的平均细胞数为（132±45）个，对照组穿过基质胶的平均细胞数为（622±76）个。

图1

2.3 MiR-145直接靶向ANGPT2及对ANGPT2蛋白表达的影响：经双荧光报告基因分析，HEK293T细胞转染pSIF-miR-145、pRL-TKANGPT2野生质粒后，荧光素酶的活性显著降低；而共转染了pSIFmiR-145、pRL-TK-ANGPT2-mut质粒后，细胞中荧光素酶活性无变化，即miR-145直接靶向ANGPT2。SK-BR-3中转染pSIF-miR-145或空载质粒，检测ANGPT2的表达，观察图2可知，ANGPT2蛋白较阴性对照组显著下调，即认为miR-145对ANGPT2蛋白表达有抑制作用。

图2

3 讨 论

本次研究结果显示经实时FQ-PC检测乳腺癌组织和癌旁组织中miR-145的相对表达量分别为（49.85±21.02）、（185.04±42.64）；实时FQ-PCR检测对数生长期乳癌细胞系的miR-145表达，MCF-7为（0.50±0.04）、MDA-MB-231（0.06±0.01）、MDA-MB-468（0.35±0.03）、SK-B-3（0.04±0.01），呈现为低表达。miR-145直接靶向ANGPT2，且ANGPT2蛋白较阴性对照组显著下调，即认为miR-145对ANGPT2蛋白表达有抑制作用。根据相关研究可知，在人类复杂的基因调控网中，microRNA至关重要，而其通过其种子序列完全或部分与靶mRNA的3'UTR端互补配对，实现对目的基因的抑制[7-9]。当前认为miR-145在多种肿瘤中起到的是抑癌基因的作用，且本次研究结果证实，其对ANGPT2蛋白表达有抑制作用。肿瘤的生长和远处转移依赖血管的形成，ANGPT2作为血管生成素家族成员，促进肿瘤的侵袭转移，其即促进肿瘤血管的新生，又阻碍血管的完整性[10]。此外ANGPT2能够通过α5β1整合素/ILK-Akt-GSK-3β-Snail介导的信号通路来诱导乳腺癌细胞的转移促进癌细胞的侵袭转移，而且其作为miR-145的靶基因，能够通过靶向抑制ANGPT2来参与乳腺癌转移的过程。

综上所述，miR-145在乳腺癌中的表达偏低，可通过靶向调控ANGPT2蛋白来抑制乳腺癌的侵袭转移。