枯草芽孢杆菌和绿色木霉协同促进芹菜生长的研究

周 游 ，杨腊英 ，汪 军 ，郭立佳 ，梁昌聪 ，刘 磊 ，黄俊生 *

（1.中国热带农业科学院环境与植物保护研究所，海南 海口 571101；2.农业农村部热带作物有害生物综合治理重点实验室，海南 海口 571101）

芹菜（Apium graveolens L.）富含蛋白质、维生素、钙、磷、铁等20多种营养物质，是我国国民广泛食用的蔬菜［1-2］。随着对芹菜需求的日益加大，不少学者通过提高大量元素供给，施用黄腐酸钾和生长调节剂等物质，或者利用微生物等手段研究提高芹菜产量的方法［3-6］。

前人研究表明，复合使用不同类型的微生物比使用单一微生物对植物的促生和控制植物病害的效果更好，呈现增效作用［7-9］。可能的原因是不同类型的微生物对植物和对病原菌的作用方式不同，分泌的作用物质也不同［10-11］。有研究表明，不同种类的微生物共同培养后会加大有益物质的分泌，例如Trichoderma asperellum和Bacillus amyloliquefaciens共同培养后会加大D-天冬氨酸等8种氨基酸的分泌［12］。并且不同种类菌株共同培养时会诱导单独培养时沉默基因的表达，Schroeckh等发现，Streptomyces hygroscopicus（现为S.rapamycinicus）和Aspergillus nidulans共培养后，能激活A.nidulans沉默的polyketide synthase（PKS）基因簇表达［13］。值得注意的是，不同种类菌株共同培养也能诱导产生新的物质，Dashti等将 Actinokineospora sp.和Nocardiopsis sp.共同培养后分离出在单独存在的情况下不能产生的3种新物质［14］。但以往研究多关注于两种微生物之间的相互作用结果，而关于复合微生物促进植物生长的协同增效机制尚不清楚，且研究报道极为鲜见。木霉和芽孢杆菌是目前广泛用来生产微生物菌肥的菌种。因此，本研究通过比较绿色木霉和枯草芽孢杆菌在单独和混合施用情况下，对芹菜的防御酶活性和代谢物含量的影响情况来探明这两种微生物对芹菜生长的协同增效作用的机制。这将为微生物的复合使用提供理论基础，也为芹菜的高产栽培提供有效的技术支撑。

1 材料与方法

1.1 供试菌株

①枯草芽孢杆菌（BLG010）（专利号：CN102747020A）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供，菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.5953。将BLG010接种在LB液体培养基中，在37℃条件下180 r/min黑暗培养2 d后离心去除LB培养液获得纯孢子体，并用无菌蒸馏水把孢子稀释成1.0×107个/mL浓度的孢子悬浮液。

②绿色木霉（H06）（专利号：CN102839131A）由中国热带农业科学院环境与植物保护研究所提供，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.6229。将H06接种到PDA平板上，在27℃条件下黑暗培养9 d，并刮取孢子用无菌蒸馏水制成孢子悬浮液（浓度为1.0×107个/mL）；

1.2 盆栽试验

2018年1月3日将长至5～6 cm的西芹幼苗移栽至混合有灭菌的菜园土、营养土以及椰糠作为栽培基质的花盆中，幼苗移栽时各花盆均施用市购复合肥（N∶P∶K=15∶15∶15）1∶900倍液500 mL。移栽5 d后按以下4个处理浇灌芹菜，每处理设3个重复，每个重复含12株芹菜。移栽30 d后收获芹菜，测定株高和鲜重。

①蒸馏水处理（CK）：每花盆浇灌300 mL 的无菌蒸馏水。

②BLG010处理：每花盆浇灌300 mL的BLG010 孢子悬浮液（1.0×107个/mL）。

③H06处理：每花盆浇灌300 mL 的H06 孢子悬浮液（1.0×107个 /mL）。

④BLG010+H06处理：每花盆浇灌各150 mL的BLG010和H06孢子悬浮液（1.0×107个/mL）。

1.3 酶活性测定

分别于处理后10、20 d时采集4个处理的距离地面1～5 cm处茎秆用于提取总酶液，每6个茎秆作为一个重复。根据吴卫等的方法获得含有过氧化氢酶（CAT）和过氧化物酶（POD）的总酶液［15］。过氧化氢酶（CAT）活性利用H2O2测定［16］；过氧化物酶（POD）活性采用愈创木酚法测定［17］。

1.4 差异代谢物GC-MS分析

分别于处理后10、20 d时采集4个处理的距离地面1～5 cm处茎秆用于代谢物检测，每6个茎秆作为一个重复。气质联用仪型号为Thermo TRACE1310/ISQTMQD GC-MS。

①代谢物提取及衍生化：根据Lisec等的方法提取代谢物，以核糖醇（0.2 mg/mL）作为内标［18］。利用甲氧基胺基盐酸盐吡啶溶液（吡啶含量为20 mg/mL）与N，O-双（三甲基硅烷基）三氟乙酰胺（含1% 三甲基氯硅烷）对代谢物进行衍生化。

②色谱和质谱条件：毛细管色谱柱为Thermo TG-5MS（30 m×0.25 mm×0.25 μ m），不分流进样，1.0 mL/min恒流模式。升温程序为：初始温度80℃，维持2 min，然后以5℃/min的速度升至300℃，维持1 min。进样口温度设定为 250℃。EI离子源，温度250℃，电子轰击电压为70 eV。质谱检测范围为45～600 m/z。每0.2 s扫描一次，溶剂延迟3 min。样品采用随机顺序连续自动进样。

③数据处理：对样品的总离子图进行色谱峰识别，并与NIST质谱数据库比对，鉴定代谢物的种类，使用自动积分方法进行积分并进行手动积分校正，对代谢产物进行的定性和定量分析。

2 结果与分析

2.1 不同处理对芹菜生长的影响

由图1和图2可见，同时浇灌枯草芽孢杆菌（BLG010）和绿色木霉（H06）的处理比其它处理长势良好。BLG010+H06处理的株高分别是CK、BLG010、H06处理的1.44、1.13、1.21倍；株重分别是CK、BLG010、H06处理的3.4、1.39、2.07倍，这说明BLG010和H06对芹菜的促生具有协同增效作用。

图1 不同处理对芹菜生长的影响

图2 不同处理对芹菜株高和株重的影响

2.2 不同处理对芹菜酶活性的影响

经过分析得知，CAT与POD活性在4个处理间表现出规律性变化。由图3和图4可知，BLG010+H06处理的CAT和POD活性在第10 d和第20 d时均比其它处理高，CK处理在第10 d和第20 d时的POD和CAT活性均比其它处理低。

图3 不同处理对芹菜CAT活性的影响

图4 不同处理对芹菜POD活性的影响

图5 芹菜代谢物GC-MS总离子流色谱图

在 第10 d时，BLG010+H06处 理 的POD活性分别为BLG010和H06处理的1.23和1.36倍；BLG010+H06处理的CAT活性分别为BLG010和H06处理的1.03和1.4倍。

在 第20 d时，BLG010+H06处 理 的POD活性分别为BLG010和H06处理的1.25和1.22倍；BLG010+H06处理的CAT活性分别为BLG010和H06处理的1.78和1.45倍。

由结果可知，BLG010和H06均能提高芹菜CAT和POD活性，但是同时浇灌BLG010和H06比单独浇灌BLG010或H06对芹菜的CAT和POD活性具有更强的诱导能力，这也说明BLG010和H06对芹菜防御酶活性诱导具有协同增效作用。

2.3 不同处理对芹菜代谢物的影响

各处理样品的GC-MS 总离子流色谱图峰形较好（图5），可根据峰面积计算代谢物质相对含量和通过NIST标准谱库确认各峰的化学结构。由结果可知，苹果酸、甘露醇和蔗糖这3种物质相对含量在不同处理间呈现规律性的差异。

与CK处理相比，BLG010、H06、BLG010+H06处理的甘露醇含量在第10 d和20 d两个时间点均上调表达（图6），处理间的含量大小顺序为：BLG010+H06＞BLG010＞H06＞CK 处理。

由图7可知，与CK处理相比，BLG010+H06处理的苹果酸含量在第10 d和20 d两个时间点均上调表达，而BLG010处理、H06处理的苹果酸含量在第10 d表达下调，但随后BLG010处理的苹果酸含量在第20 d上调表达。

图6 不同处理对芹菜甘露醇含量的影响

图7 不同处理对芹菜苹果酸含量的影响

由图8可知，在第10 d，CK处理的蔗糖含量分别是BLG010、H06、BLG010+H06处理蔗糖含量的5.78、2.33和7.01倍。但是在第20 d时，BLG010、H06、BLG010+H06处理的蔗糖含量分别是CK处理蔗糖含量的1.98、1.3和7.22倍。

结果表明，接种枯草芽孢杆菌或绿色木霉均能引起芹菜的苹果酸、甘露醇和蔗糖含量变化，而混合接种枯草芽孢杆菌和绿色木霉则能导致这些变化程度加大。

3 结论与讨论

POD和CAT是植物生长过程中的重要抗性相关酶，其活性变化情况是反映植物抗病性的重要生理指标［19-20］，众多学者利用生防菌接种寄主植物来提高寄主的CAT和POD活性，由此使寄主获得诱导系统抗性（Induced systemic resistance，ISR）。因此，测定枯草芽孢杆菌和绿色木霉在单独和混合施用条件下对芹菜的CAT和POD活性影响，能探明这两种生防菌对芹菜的防御酶是否有增效作用，也间接为其它生防菌的复合使用提供理论支撑。

图8 不同处理对芹菜蔗糖含量的影响

本研究发现枯草芽孢杆菌和绿色木霉均能提高芹菜CAT和POD活性，且两者混合接种芹菜提高这两种酶的活性更高，呈现增效作用，这可能是两种生防菌对芹菜的刺激比单一生防菌的刺激作用强，加强了激活CAT和POD活性的过程，这和前人的报道类似［21-22］，他们发现接种病原菌和芽孢杆菌处理的CAT和POD等抗性相关酶活性比只单独接种病原菌或者生防菌的高。

本研究也发现，株高最高和株重最重的芹菜处理，其CAT和POD活性也最大，这与吕斌等［23］和赵英等［24］的研究类似，他们发现POD和SOD等抗性相关酶的活性与植物的生长势有相关关系。因此将来可以进行深入的研究，探清芹菜CAT和POD活性与芹菜株高与株重的相关关系，作为预测微生物提高芹菜产量能力的检测指标。

代谢物的变化可视为植物对外界环境变化的响应，研究植物响应外源微生物的代谢组不仅能描述植物的状态，也能了解植物与微生物互作的机制。本文对4个处理的芹菜进行代谢组分析，结果发现，苹果酸、甘露醇和蔗糖的含量在不同处理间呈现规律性的差异，这些差异变化是芹菜对枯草芽孢杆菌和绿色木霉的响应。

苹果酸是三羧酸（TCA）循环的中间产物，参与多种代谢反应的调控，能生成蔗糖、丙酮酸、草酰乙酸等物质，是一种重要的能量物质［25］。本研究中，在两个时间段，BLG010+H06处理的苹果酸均比CK处理和其它处理高，这与董鲜等［26］和张风革［27］的研究类似，他们发现植物接种微生物后，其体内的苹果酸含量上调。造成这种现象的可能原因是，芽孢杆菌和木霉对苹果酸具有趋化性，苹果酸可作为芽孢杆菌和木霉的营养来源之一，芹菜加大苹果酸的分泌能促进这两种微生物在植物根部定殖［27-28］；也有可能是，在两种生防菌的共同作用下，刺激芹菜上调苹果酸产量进而转化为糖类，为芹菜的生长发育提供能量，从而达到显著促进芹菜生长的目的。但是，第10 d时BLG010处理和H06处理、第20 d时H06处理的苹果酸含量均比CK处理低，具体机理有待进一步研究。

本研究发现，BLG010和H06均能诱导芹菜甘露醇累积，并且两种生防菌共同处理的芹菜甘露醇相对含量比单一生防菌处理的高，这和Luo等［29］的研究结果类似，他们发现利用菌根真菌接种杨树后，甘露醇在杨树体内累积。甘露醇是植物体内重要的渗透压调节物质［30］，微生物与植物作用后会导致植物的渗透势发生改变［31］，由此推测，芽孢杆菌和木霉处理芹菜导致其甘露醇累积的原因可能是，芹菜需要调节由这两种微生物造成的渗透压失衡，故而加大甘露醇的分泌，并且两种微生物比单一微生物使芹菜累积甘露醇的作用更强，但是甘露醇与芹菜生长势之间的关系需要进一步研究。

蔗糖能分解成果糖和葡萄糖，是植物体内重要的能源物质也是分子信号，是源库碳水化合物代谢的枢纽，能影响植物生长发育过程中的基因表达［32-33］。植物根系的蔗糖是木霉的能量来源，但是木霉获得足够的蔗糖后就下调其自身的蔗糖水解酶活性，以避免其对寄主蔗糖的过量吸收而导致寄主组织的破坏［34］。邹英宁等［35］研究表明，柑橘接种丛枝菌根真菌能提高其株高和叶片数以及叶片蔗糖含量，经分析得知菌根侵染率与叶片蔗糖含量正相关，他们认为叶片产生的蔗糖向根部运输并分解为葡萄糖和果糖供给菌根真菌吸收利用。本研究结果表明，在第10 d时，各处理的蔗糖含量表现为CK处理＞BLG010处理＞H06处理＞BLG010+H06处理，在第20 d时各处理的蔗糖含量出现反转，表现为BLG010+H06处理＞BLG010处理＞H06处理＞CK，这可能的原因是在枯草芽孢杆菌和绿色木霉定殖根部初期，芹菜产生的蔗糖向下运输给这两种生防菌使用，导致茎部蔗糖含量变低，当它们获得足够的蔗糖后产生调节信号给芹菜，芹菜调节蔗糖相关酶的活性，提高体内蔗糖含量用于促进自身生长。这与刘春娟等［36］的研究类似，他们发现大豆叶片的蔗糖含量与大豆的产量正相关。本研究中，BLG010和H06联合接种对提高芹菜的蔗糖含量呈现出了增效效应，这可能是BLG010和H06促进芹菜生长呈现协同增效现象的原因之一。

综上所述，本研究发现接种枯草芽孢杆菌（BLG010）和绿色木霉（H06）能促进芹菜的生长，并且同时接种BLG010和H06比单独接种BLG010或H06促进芹菜生长的效果更好。同时还发现，芹菜CAT和POD活性、苹果酸、甘露醇和蔗糖的含量在不同处理间呈现规律性的差异，这些差异变化可能是枯草芽孢杆菌和绿色木霉促进芹菜生长呈现协同增效的原因。这些研究结果将为生防菌的复合使用提供新思路，为芹菜的高产栽培提供技术支撑。