宫颈病变患者外周血中TH1/TH2漂移状态与T-bet/GATA-3的表达及意义

赛星月 李晓红 杜蓉

[摘要] 目的 研究宮颈病变患者转录因子GATA-3、T-bet与TH细胞因子的相关性及其在外周血中的表达水平及意义。 方法 选择2017年1月～2019年1月新疆医科大学第一附属医院就诊的76例患者，根据宫颈液基细胞学检测分为对照组（33例）、低度鳞状上皮内病变（L-SIL）组（10例）及高度鳞状上皮内病变（H-SIL）组（33例）。Rt-PCR检测血清GATA-3及T-bet表达量，流式细胞学检测三组血清TH细胞因子含量，相关性分析采用Pearson相关分析。 结果 H-SIL组、L-SIL组白细胞介素（IL）-4、IL-10表达水平高于对照组，GATA-3表达量高于对照组，L-SIL组T-bet表达量低于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。IFN-γ与T-bet呈正相关（r = 0.65，P < 0.05），与GATA-3呈负相关（r = -0.51，P < 0.05）;IL-4与GATA-3呈正相关（r = 0.56，P < 0.05），与T-bet呈负相关（r = -0.72，P < 0.05）;IL-10与T-bet呈负相关（r = -0.65，P < 0.05）。 结论 L-SIL患者的外周血中表现为TH1细胞优势，T-bet的基因表达上调，而H-SIL患者表现为TH2细胞优势，T-bet的基因表达下调。可见，L-SIL、H-SIL的发生与TH细胞因子、GATA及T-bet具有相关性。

[关键词] 细胞因子;转录因子;宫颈病变

[中图分类号] R737.33          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）04（b）-0076-04

Expression and significance of TH1/TH2 drift and T-bet/GABA-3 in peripheral blood of patients with cervical lesions

SAI Xingyue   LI xiaohong   DU Rong

Department of Gynaecology， the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University， Xinjiang Uygur Autonomous Region， Urumqi   830054， China

[Abstract] Objective To study the correction between transcription factors GATA-3，T-bet and TH cytokine in patients with cervical lesions and their expression level and significance in peripheral blood. Methods A total of 76 patients who were admitted to the First Affiliated Hospital of Xinjiang Medical University from January 2017 to January 2019 were selected. According to the cervical thinprep cytologic test， they were divided into control group （33 cases）， low-grade squamous intraepithelial lesion （L-SIL） group （10 cases） and high-grade squamous intraepithelial lesion （H-SIL） group （33 cases）. The expression levels of GATA-3 and T-bet in serum were detected by Rt-PCR， and the TH cytokine levels in serum of three groups were detected by flow cytometry. Pearson correlation analysis was used for correlation analysis. Results The expressions of interleukin （IL）-4 and IL-10 in H-SIL group and L-SIL group were higher than those in control group， and the expression of GATA-3 was higher than that in control group， while the expression of T-bet in L-SIL group was lower than that in control group， and the differences were statistically significant （all P < 0.05）. IFN-γ was positively correlated with T-bet （r = 0.65， P < 0.05）， and negatively correlated with GATA-3 （r = -0.51， P < 0.05）. IL-4 was positively correlated with GATA -3 （r = 0.56， P < 0.05）， and negatively correlated with T-bet （r = -0.72， P < 0.05）. IL-10 was negatively correlated with T-bet （r = -0.65， P < 0.05）. Conclusion Peripheral blood of patients with L-SIL shows dominance of TH1 cells and up-regulated T-bet gene expression， while that of patients of H-SIL shows dominance of TH2 cells and down-regulated T-bet gene expression. It can be seen that the occurrence of L-SIL and H-SIL is related to TH cytokines， GATA and T-bet.

[Key words] Cytokines; Transcription factors; Cervical lesions

我国宫颈癌的病死率居世界第二，从正常宫颈发展为高度鳞状上皮内病变（H-SIL）需8～10年，此时机体的免疫状态起到关键作用[1]，高危型人乳头状瘤病毒（HPV）持续感染是导致宫颈癌的主要原因[2]。研究发现[3-4]，低度鳞状上皮内病变（L-SIL）患者的T细胞主要为辅助性T细胞1（TH1型），而H-SIL患者主要为辅助性T细胞2（TH2型），宫颈组织中进行免疫调节的可能是TH1/TH2相关因子。CD4（分化群4）T细胞的表达模式分为TH1型和TH2型，而白细胞介素（IL）-2、IL-12、γ干扰素（IFN-γ）促进TH1型分化，IL-4、IL-10促进TH2型分化[5]，TH细胞分化受多因素调节，其中GATA-3及T-bet的调节对TH细胞分化起重要作用，T-bet正调节TH1型相关因子，GATA-3正调节TH2型相关因子，所以检测正常人及宫颈病变患者外周血上述因子的含量及比值，可能发现TH1/TH2的平衡关系。为明确TH1/TH2与宫颈病变的关系，本研究检测外周血TH1/TH2含量从而了解不同级别宫颈病变表达水平及差异。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2017年1月～2019年1月新疆医科大学第一附属医院（以下简称“我院”）就诊的76例患者，依据WHO女性生殖系统肿瘤分类[6]进行诊断，将经宫颈液基细胞学检测（TCT）结果分为对照组（33例），L-SIL组（10例）及H-SIL组（33例），且L-SIL组与H-SIL组经阴道镜活检确诊。排除受试者未受化疗及免疫治疗、自身免疫病、血液病、妊娠、过敏等可能影响结果的疾病。

患者均女性，对照组，年龄18～77岁，平均（42.63±14.47）岁;L-SIL组，年龄43～50岁，平均（46.4±2.42）岁;H-SIL组，年龄33～67岁，平均（46.77±10.21）岁。三组年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。本研究经我院医学伦理委员会批准，受试者均签署知情同意书。

1.2 试剂与仪器

淋巴细胞分离液（200 mL/瓶，LTS1077）购自天津TBD公司，总RNA提取试剂（Trizol）（100 mL/瓶，15596026）购自Invitrogen公司，T-bet及GATA-3引物序列由华大基因设计合成，SYBR GREEN PCR试剂盒（208054）购自凯杰有限公司，cDNA逆转录试剂盒（#K1622）购自Thermo Scientific公司。

1.3 标本的收集与处理

采集受试者空腹血10 mL，淋巴细胞分离液分离外周血单个核细胞，室温下以2000 r/min离心20 min获得单个核细胞层，移入离心管，PBS混匀，洗涤再离心得到单个核细胞，加入1 mL Trizol静置10 min，-80℃冻存。

1.4 Rt-PCR检测T-bet和GATA-3 mRNA表达水平

Rt-PCR检测GATA、T-bet及内参β-actin（各引物序列及扩增长度见表1）。按照说明书提取总RNA，反转录试剂盒反转录，结束进行扩增，反应体系按说明配制，扩增条件为：95℃ 2 min，95℃ 5 s，60℃ 10 s，共35个循环，循环后采集扩增曲线生成熔点曲线。记录循环阈值（Ct），采用2-△△Ct计算mRNA的相对表达量，其中△Ct=目标基因Ct值-内参β-actin Ct值。每个样本重复3次，取平均值。

表1   各引物序列及扩增长度

1.5 统计学方法

采用SPSS 22.0进行统计学处理，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，两组间比较采用t检验;相关性分析采用Pearson相关分析，以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1  三组TH细胞因子水平比较

三组TH细胞因子水平比较，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。H-SIL组、LSIL组中IL-4、IL-10水平高于对照组，两组中IFN-γ、IL-2水平均低于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）;H-SIL組与L-SIL组TH细胞因子水平比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表2。

表2   三组TH细胞因子水平比较（x±s）

注：与对照组比较，*P < 0.05。L-SIL：低度鳞状上皮内病变;H-SIL：高度鳞状上皮内病变;IL：白细胞介素;IFN-γ：γ干扰素

2.2三组T-bet及GATA-3表达量比较

三组T-bet及GATA-3表达量比较，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。H-SIL组、L-SIL组GATA-3表达量明显高于对照组，L-SIL组T-bet表达量低于对照组，差异均有统计学意义（均P < 0.05）。L-SIL组与H-SIL组T-bet及GATA-3表达量比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见表3。

表3   三组T-bet及GATA-3表达量比较（x±s）

注：与对照组比较，*P < 0.05。L-SIL：低度鳞状上皮内病变;H-SIL：高度鳞状上皮内病变

2.3 相关性分析结果

IFN-γ与T-bet呈正相关（r = 0.65，P < 0.05），与GATA-3呈负相关（r = -0.51，P < 0.05）;IL-4与GATA-3呈正相关（r = 0.56，P < 0.05），与T-bet呈负相关（r = -0.72，P < 0.05）;IL-10与T-bet呈负相关（r = -0.65，P < 0.05）。见图1。

3 讨论

细胞因子、胞内信号传导通路和核转录因子这三个环节是近代免疫学调控TH1/TH2的重要环节[7]，免疫调节在很多肿瘤的发展中起决定性作用[8-10]，HPV感染有自限性，可通过免疫调节控制HPV持续性感染[11]。研究显示[12]，抗肿瘤作用依赖TH1型细胞，TH1型细胞分泌IFN-γ、IL-2等细胞因子[13];判断宫颈癌重要指标为IFN-γ[14]，可见细胞因子与宫颈病变密切相关;TH2型细胞为IL-4、IL-10等[15]。IL-10水平上升不利于机体抗肿瘤作用，实验显示[17]，IL-10水平升高可作为评估肿瘤进展的标志。本研究结果显示，H-SIL组IL-10水平高于对照组，呈向TH2漂移状态;IFN-γ水平低于对照组，呈向TH1偏移状态，提示TH1/TH2平衡状态的改变与宫颈病变的发展有密切的联系，这与李锋等[12]研究相符。可见TH细胞因子间的平衡关系与宫颈病变发展存在一定关系。

T-bet与GATA-3是调节平衡的重要因子，本研究结果显示，H-SIL组GATA-3表达量高于对照组，T-bet表达量低于对照组。可见随宫颈病变程度加重，GATA-3含量也有上升趋势。相关研究发现[18]，T-bet正调节TH1型细胞因子，GATA-3正调节TH2型细胞因子，TH1型特异转录因子为T-bet，促进IFN-γ表达及TH1细胞因子分化;而TH2型特异转录因子为GATA-3，促进TH2型细胞因子的表达[19]。本研究结果显示，TH1型细胞因子与T-bet表达正相关，TH2型细胞因子与T-bet负相关，故推测T-bet/GATA-3与TH1/TH2的平衡有关，这在食管癌相关研究中也有体现[20]。

综上所述，可通过检测相关细胞因子含量了解患者的免疫状态，也可将转录因子T-bet及GATA-3做为靶点，使TH1及TH2维持在平衡状态，从而逆转肿瘤的发生。

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（收稿日期：2019-10-17  本文编辑：刘明玉）