补肾化痰方对绝经后骨质疏松模型大鼠骨重建平衡的影响

周亚娜 周广文 张麟 张妍 谭张奎 李章青 黄诗怡 熊梦欣 向楠

[摘要] 目的 观察补肾化痰方对绝经后骨质疏松（PMOP）模型大鼠骨重建平衡的影响。 方法 选取6月龄SD雌性大鼠30只，按照随机数字表法将其分为假手术组、模型组及中药组，每组10只。假手术组及中药组均以卵巢切除术造模，假手术组仅切除卵巢旁等量脂肪。术后5周开始灌胃，中药组给予补肾化痰方，假手术组和模型组灌服等量生理盐水。12周末大鼠处死后取材，分别采用酶联免疫吸附测定法、蛋白质印迹法及免疫组化法检测血清及骨组织骨形态发生蛋白2（BMP2）、Runt相关转录因子2（RUNX2）、骨保护素（OPG）、核因子κB受体活化因子配体（RANKL）的含量及定位，采用micro CT检测大鼠的骨密度，比较分析各组间各个指标的差异。 结果 模型组和中药组大鼠骨密度及血清BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL含量均低于假手术组，RANKL含量高于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.05）。中药组大鼠骨密度及血清BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL含量均高于模型组，RANKL含量低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。模型组和中藥组大鼠骨组织BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL灰度值均低于假手术组，RANKL灰度值高于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.05）。中药组大鼠骨组织BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL灰度值均高于模型组，RANKL灰度值低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。免疫组化结果显示，BMP2、RUNX2、OPG的阳性表达主要位于骨髓基质细胞胞浆及骨小梁周边成骨细胞中;RANKL的阳性表达位于骨质边缘破骨细胞中，呈棕黄色颗粒。 结论 补肾化痰方能够通过BMP2/Smad/RUNX2信号通路及OPG/RANKL/RANK信号通路调控骨重建平衡，从而起到治疗PMOP的作用。

[关键词] 补肾化痰方;骨组织骨形态发生蛋白2/Smad/Runt相关转录因子2;骨保护素/核因子κB受体活化因子配体/核因子κB受体活化因子;绝经后骨质疏松

[中图分类号] R-332          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）04（b）-0008-05

Effect of Bushen Huatan Decoction on bone remodeling balance in ovariectomized osteoporosis rats

ZHOU Ya′na1*   ZHOU Guangwen2*   ZHANG Lin3   ZHANG Yan4   TAN Zhangkui4   LI Zhangqing4   HUANG Shiyi4   XIONG Mengxin4   XIANG Nan4

1.Department of Oncology， Hubei Provincial Hospital of Traditional Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan   430061， China; 2.College of Acupuncture and Bone Injury， Hubei University of Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan   430065， China; 3.Department of Osteoarticular Surgery， Wuhan Hospital of Traditional Chinese and Western Medicine  Wuhan NO.1 Hospital， Hubei Province， Wuhan   430061， China; 4.the First Clinical College， Hubei University of Chinese Medicine， Hubei Province， Wuhan   430065， China

[Abstract] Objective To study the effect of Bushen Huatan Decoction on bone remodeling balance in ovariectomized osteoporosis rats. Methods Thirty-six month old female SD rats were divided into three groups： sham operation group， model group and traditional Chinese medicine group according to the random number table method， with 10 rats in each group. In sham operation group and traditional Chinese medicine group， the model was made by ovariectomy. In sham operation group， only the same amount of fat was removed. 5 weeks after operation， rats in traditional Chinese medicine group were given Bushen Huatan Decoction， and rats in sham operation group and model group were given the same amount of normal saline. 12 weeks after rats were killed， the content and localization of bone morphogenetic protein 2 （BMP2）， runt related transcription factor 2 （RUNX2）， osteoprotegerin （OPG）， nuclear factor kappa B receptor activating factor ligand （RANKL） in serum and bone tissue were detected by enzyme-linked immunosorbent assay， Western blot and immunohistochemistry respectively. Bone mineral density of rats was measured by micro CT， and the differences of each index between each group were analyzed. Results Bone mineral density and serum BMP2， RUNX2， OPG and OPG/RANKL contents of model group and traditional Chinese medicine group were lower than those of sham operation group， and RANKL content was higher than that of sham operation group， with statistically significant differences （P < 0.05）. Bone mineral density and serum BMP2， RUNX2， OPG， OPG/RANKL content of the rats in traditional Chinese medicine group were higher than those in model group， and RANKL content was lower than that in model group， with statistically significant difference （P < 0.05）. BMP2， RUNX2， OPG and OPG/RANKL gray values of bone tissue in model group and traditional Chinese medicine group were lower than those in sham operation group， and the RANKL gray values were higher than those in sham operation group （P < 0.05）. BMP2， RUNX2， OPG and OPG/RANKL gray values of bone tissue in traditional Chinese medicine group were higher than those in model group， and RANKL gray values were lower than those in model group， the differences were statistically significant （P < 0.05）. The results of immunohistochemistry showed that the positive expression of BMP2， RUNX2 and OPG was mainly located in the cytoplasm of bone marrow stromal cells and osteoblasts around the trabecula; the positive expression of RANKL was located in osteoclasts at the border of bone， which were brownish yellow granules. Conclusion Bushen Huatan Decoction can regulate bone remodeling balance through BMP2/Smad/RUNX2 signal pathway and OPG/RANKL/RANK signal pathway to treat postmenopausal osteoporosis.

[Key words] Bushen Huatan Decoction; BMP2/Smad/RUNX2; OPG/RANKL/RANK; Postmenopausal osteoporosis

绝经后骨质疏松（PMOP）是全身代谢性骨病，以骨量减少、骨微结构破坏、骨脆性增加、易发骨折为特征，致残率和致死率高，严重威胁中老年妇女的健康[1]。现代研究表明，PMOP的发生与骨形成[成骨细胞（OB）介导]和骨吸收[破骨细胞（OC）介导]之间动态失衡密切相关。调控骨组织骨形态发生蛋白2（BMP2）/Smad/Runt相關转录因子2（RUNX2）信号通路会影响OB的分化及骨细胞外基质合成与分泌，能够促进骨的形成及增加骨的含量[2];而在骨吸收和骨形成的偶联中，骨保护素（OPG）/核因子κB受体活化因子配体（RANKL）/核因子κB受体活化因子（RANK）信号通路起关键作用[3]。中医药防治PMOP是我国独具特色和优势的治疗方式，在改善患者临床症状方面疗效显著[4]。湖北名师向楠教授基于痰浊在骨质疏松症发病中的作用，结合《本草纲目》补骨脂丸与《丹溪心法》黄瓜蒌丸加减而成补肾化痰方[5-6]。在临床中，向楠教授以此方为基础方，辨证论治PMOP，取得了良好的临床效果，并对其作用机制进行了一系列研究[7-9]。本研究旨在探讨补肾化痰方对PMOP大鼠骨重建平衡的影响。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF级SD大鼠，6月龄，雌性，体重250～350 g，共30只，由华中科技大学同济医学院提供，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2015-0018，实验动物合格证号：42000600017470。饲养于湖北中医药大学实验动物中心，温度18～25℃，湿度45%～55%，保证饲料饮水充足。实验由湖北中医药大学实验动物伦理审查委员会审查通过。

1.2 药物与试剂

补肾化痰方由淫羊藿、补骨脂、菟丝子、全瓜蒌、红曲、山楂构成（含量分别为10、15、30、15、12、20 g）;湖北省中医院门诊部药房提供研究用生药，并由实验研究人员加水煎煮浓缩，于4℃冰箱贮存备用。试剂：大鼠OPG试剂盒（货号：JYM0510Ra）、RANKL试剂盒（货号：JYM0391Ra）、BMP2试剂盒（货号：JYM0665Ra）、RUNX2试剂盒（货号：JYM0899Ra）均由武汉基因美生物科技有限公司提供;OPG抗体（货号：Ab73400）、BMP2抗体（货号：Ab14933）、大鼠RUNX2抗体（货号：Ab23981m）均购自Abcam;RANKL抗体（货号：Sc-7628，Snata）。

1.3 仪器与设备

uCT50（SCANCO MEDICAL，瑞士）;MK3酶标仪（Lab systems Multi-skan MS公司，芬兰）;Tanon-5200全自动化学发光分析仪（上海天能公司）;RM2235石蜡切片机（徕卡显微系统有限公司）。

1.4 实验动物分组与给药

适应性喂养大鼠，1周后腹腔注射1%戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下俯卧固定，背侧正中切口后按照随机数字表法分组处理。假手术组仅切除卵巢周围与双侧卵巢重量等同的脂肪组织，而不摘除卵巢;模型组与中药组均行卵巢切除术建立PMOP大鼠模型，在肾下极附近寻找到卵巢后用4号线结扎并双侧摘除，分层缝合切口。造模术后5周，开始给药;假手术组和模型组均灌胃1 mL/100 g的生理盐水，中药组以0.94 g/mL灌胃补肾化痰方，1次/d，持续8周。

1.5 血清BMP2、RUNX2、OPG、RANKL检测

12周末，大鼠眼球取血，肝素抗凝，30 min内3000 r/min（离心半径为8 cm）离心，取上清，保存于 -20℃冰箱备用。采用酶联免疫吸附测定（ELISA）参照试剂盒说明检测血清BMP2、RUNX2、OPG、RANKL含量。

1.6 骨组织BMP2、RUNX2、OPG、RANKL蛋白检测

12周末，大鼠处死后，取右侧股骨洗净。取部分骨片研磨、提取蛋白，蛋白质印迹法检测骨组织BMP2、RUNX2、OPG、RANKL蛋白的表达，其余部分放入4%多聚甲醛固定液中固定、脱钙，免疫组化检测BMP2、RUNX2、OPG、RANKL定位。

1.7 骨密度及骨微结构检测

取大鼠左侧的股骨放在micro CT载物台上固定。以360°扫描角度、15 μm的扫描分辨率，沿大鼠股骨长轴方向，对股骨近干骺段，进行X线扫描，以获取到连续、平面的μ-CT图像。扫描完成后，选取生长板远端骨组织作为松质骨感兴趣区域，将最低阈值设为170，来进行股骨的三维重组，并提取图像信息，最后用自带软件进行定量分析。

1.8 统计学方法

数据分析用SPSS 19.0统计软件。计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用Tukey检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般观察

大鼠于麻醉后3～4 h全部苏醒，进食正常，活动正常，切口均无红肿、感染征象。1周后，切口愈合。灌胃时模型组和中药组分别有1只和2只大鼠死亡。

2.2 各组大鼠骨密度及血清相关指标比较

模型组和中药组大鼠骨密度及血清BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL含量均低于假手术组，RANKL含量高于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.05）。中药组大鼠骨密度及血清BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL含量均高于模型组，RANKL含量低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表1。

2.3 各组大鼠骨组织相关指标比较

模型组和中药组大鼠骨组织BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL灰度值均低于假手术组，RANKL灰度值高于假手术组，差异有统计学意义（P < 0.05）。中药组大鼠骨组织BMP2、RUNX2、OPG、OPG/RANKL灰度值均高于模型组，RANKL灰度值低于模型组，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表2、图1。

免疫组化结果显示，BMP2、RUNX2、OPG的阳性表达主要位于骨髓基质细胞胞浆及骨小梁周边OB中（图2～4，封四）;RANKL的阳性表达位于骨质边缘OC中，呈棕黄色颗粒（图5，封四）。

3 讨论

传统中医并无PMOP的病名，而根据对其证候群的描述，医学界基本认同感PMOP应归属于“骨痿”“骨空”的范畴;而基于中医基础理论“肾主骨生髓”，目前临床多“从肾论治”PMOP[10-11]。现代研究发现，PMOP的发病与脂代谢紊乱具有紧密的相关性[12]，而多项研究指出，“痰浊”的物质基础很可能是脂质代谢紊乱[13]。基于此种认识，向楠教授提出PMOP的治疗应从痰论[14]，并将补肾化痰方作为其临床治疗PMOP的基础方。方中淫羊藿与补骨脂合用，同为君药，发挥益肾壮阳、强筋健骨的作用;菟丝子滋补肝肾、固精缩尿，全瓜蒌清热化痰，两药相须同为臣药;山楂善于消食化积、行气散瘀，红曲长于健脾消食、活血化瘀，共为佐药。诸药相合，发挥补肾益髓、化痰调脂的作用。

骨骼是具有持续重塑周期特性，正常骨代谢包括骨形成和骨吸收，两者是一对偶联关系，其动态的平衡对维持骨质及骨量至关重要。现代研究发现，多个参与骨代谢相关调控的信号通路，相互交叉，通过激活或抑制一些关键环节的细胞因子，调节OB或OC功能，进而影响骨质疏松的发病[15]。其中，BMP2/Smad/RUNX2信号转导及OPG/RANKL/RANK信号传导系统在维持骨重建平衡方面发挥重要作用。大量基础试验研究证实，调控BMP2/Smad/RUNX2信号通路能够促骨形成并增加骨量[2]。这与本研究发现基本一致，与假手术组比较，去势骨质疏松大鼠血清及骨组织BMP2、RUNX2含量明显降低，表明去势大鼠的骨形成能力下降。淫羊藿的主要活性成分是淫羊藿苷，补骨脂素是补骨脂的主要有效成分，而研究发现，淫羊藿苷、补骨脂素配伍能够通过调控BMP2及Smad1、4诱导BMSCs成骨分化，促进骨形成[16]。因此，补肾化痰方中的补肾中药可能通过提高大鼠血清及骨组织BMP2、RUNX2含量，调控BMP2/Smad/RUNX2信号转导通路，发挥促进骨形成的作用。

在巨噬细胞集落刺激因子影响下，RANK与特异性结合配体RANKL并启动细胞内信号传导，促进OC的增殖、分化与成熟。而OB和骨髓间充质干细胞分泌的OPG作为RANKL的假性受体，比膜受体RANK的结合能力强，可以竞争性结合RANKL，阻止RANKL与RANK之间的相互作用，从而抑制OC的分化与活性，抑制骨重吸收过程[17]。本研究也显示，与假手术组比较，PMOP大鼠血清及骨组织OPG含量均明显下降，而RANKL含量明显升高，且OPG/RANKL比值变化具有显著差异，提示OPG/RANKL/RANK信号通路的激活与骨质疏松的发病密切有关。研究指出，淫羊藿苷、淫羊藿总黄酮可以不同程度降低RANKL的表达，提高OPG基因表达，从而发挥促骨形成作用[18];补骨脂提取物也可通过上调OPG、下调RANKL表达提高地塞米松诱导骨质疏松症大鼠的骨密度，改善其骨生物力学[19]。菟丝子黄酮也能够调节去卵巢大鼠OPG、RANKL的水平，从而增加骨密度，改善骨质疏松症状[20]。而红曲能够通过上调OPG mRNA表达和蛋白表达，抑制RANK表达，影响OPG/RANKL/RANK通路，抑制OC分化成熟，减缓PMOP的发病[21-22]。可见，补肾化痰方可通过补肾、化痰多种中药的综合作用，提高骨组织OPG含量及OPG/RANKL比值，降低RANKL水平，发挥抑制骨吸收的作用。

综上所述，补肾化痰方可以通过调控BMP2/Smad/RUNX2信号通路及OPG/RANKL/RANK信号通路，在促进骨形成的同时，抑制骨吸收，通过恢复骨重建的平衡，发挥抗骨质疏松症的作用。

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（收稿日期：2019-08-29  本文编辑：李亚聪）