粪便基因SDC2和BMP3甲基化联合检测在结直肠癌筛查中的价值

潘辉 黄琰璎 王国新 吴辉 宋慧东 黄颖烽

[摘要] 目的 探讨粪便基因黏结蛋白聚糖2（SDC2）和骨形态发生蛋白3（BMP3）甲基化联合检测在结直肠癌筛查中的诊断性能。 方法 收集2019年5～9月广州医科大学附属市十二人民医院和中山大学附属肿瘤医院收治的64例患者粪便样本，其中肠癌组29例、腺瘤组9例、对照组（无结直肠癌、腺瘤患者）26例。提取粪便DNA，使用甲基化特异性PCR方法，检测三组患者粪便基因SDC2、BMP3甲基化情况，比较诊断结直肠癌、腺瘤的灵敏度和特异度。 结果 粪便基因SDC2和BMP3联合检测诊断结直肠癌的灵敏度高于BMP3检测，差异有统计学意义（P < 0.05）。SDC2、BMP3、联合检测诊断结直肠癌AUC值比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。联合检测AUC值高于BMP3检测，差异有统计学意义（Z = 2.361，P < 0.05）。BMP3、联合检测对不同分布部位的检出率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。结论 粪便基因SDC2和BMP3联合检测结直肠癌的诊断性能优于BMP3检测，但与SDC2检测比较无明显改善。

[关键词] 结直肠癌;筛查;粪便基因;甲基化;黏结蛋白聚糖2;骨形态发生蛋白3

[中图分类号] R735.3          [文献标识码] A          [文章編号] 1673-7210（2020）04（b）-0015-05

Value of combined detection of fecal genes SDC2 and BMP3 methylation in screening for colorectal cancer

PAN Hui1   HUANG Yanying2   WANG Guoxin3   WU Hui1   SONG Huidong4   HUANG Yingfeng1

1.Department of General Surgery， Guangzhou Twelfth People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou   510620， China; 2.Department of Colorectal Surgery， Sun Yat-sen University Cancer Center， Guangdong Province， Guangzhou   510060， China; 3.Department of Central Laboratory， Guangzhou Twelfth People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou   510620， China; 4.Department of Gastroenterology， Guangzhou Twelfth People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University， Guangdong Province， Guangzhou   510620， China

[Abstract] Objective To investigate the diagnostic performance of stool gene syndecan-2（SDC2） and bone morphogenetic protein 3（BMP3） methylation in colorectal cancer. Methods Fecal samples were collected from 64 patients admitted to Guangzhou Twelfth People′s Hospital Affiliated to Guangzhou Medical University and the Cancer Hospital Affiliated to Sun Yat-sen University from May to September 2019， of which 29 cases were in the colorectal cancer group， 9 cases were in the adenoma group， and 26 cases were in the control group （patients without colon cancer， adenoma）. Fecal DNA was extracted， and methylation-specific PCR was used to detect the methylation of fecal genes SDC2 and BMP3 of patients in three groups. The sensitivity and specificity of colorectal cancer and adenoma were compared. Results The combined detection of stool gene SDC2 and BMP3 were more sensitive than BMP3 in the diagnosis of colorectal cancer， and the differences were statistically significant （P < 0.05）. The comparison of AUC values of SDC2， BMP3， and combined detection in colorectal cancer were highly statistically significant （P < 0.01）. The AUC value of the combined test was higher than that of the BMP3 test， and the difference was statistically significant （Z = 2.361， P < 0.05）. The detection rate of BMP3 and combined detection on different distribution sites were statistically significant （P < 0.05）. Conclusion The diagnostic performance of stool gene SDC2 and BMP3 detection in colorectal cancer is better than that of BMP3 detection， but there is no significant improvement compared with SDC2 detection.

[Key words] Colorectal cancer; Screening; Fecal genes; Methylation; Syndecan-2; Bone morphogenetic protein 3

在我国，结直肠癌（CRC）是第3位常见恶性肿瘤。据国家癌症中心报道[1]，2015年新发结直肠癌约38.8万，因结直肠癌死亡患者约18.7万。结直肠癌的防控关键是早诊早治，而筛查是降低死亡率的有效方式。现阶段，结肠镜检查是结直肠癌筛查的金标准，但由于结肠镜检查是侵入性检查、需繁琐的肠道准备、有穿孔的风险等，使我国结直肠癌筛查依从性、早诊早治率较低。2012～2015年我国城市开展的一项结直肠癌筛查研究报道[2]，在近18.3万高危人群中，约2.6万完成肠镜检查，参与率为14.0%，相对较低。粪便DNA检测因其无创、方便、诊断效能高等优点有望成为理想的结直肠癌筛查方式[3-5]。DNA甲基化是肿瘤（包括结直肠癌）发生发展过程中常见的早期事件，检测特定基因的启动子区甲基化是结直肠癌检测的重要生物标志物。黏结蛋白聚糖2（SDC2）是Ⅰ型细胞表面单跨膜蛋白聚糖，是硫酸乙酰肝素蛋白聚糖家族的成员。在结直肠癌中，SDC2基因启动子区常发生异常甲基化，可做为肿瘤标志物用于结直肠癌的筛查[6-8]。骨形态发生蛋白3（BMP3）是BMP家族成员之一，不仅在胚胎发育和器官形成中发挥至关重要的作用，还能调节机体内基因转录，与多种癌症的发生发展密切相关。已有研究显示[9-10]，BMP3基因在结直肠癌中发挥着抑癌基因的功能。在大多数结直肠癌中，BMP3基因常发生高频甲基化，已做为肿瘤标志物用于结直肠癌的筛查[3]。由于结直肠癌发生发展过程是多种分子信号途径参与的遗传学或表观遗传学改变所致，联合多个基因检测的诊断性能优于单个基因检测的诊断性能[11-14]。然而，国内外鲜见在粪便样本中联合检测SDC2和BMP3基因甲基化来筛查结直肠癌的相关研究。因此，本研究以结肠镜检查和病理诊断作为“金标准”，利用甲基化特异性PCR（MSP）技术，检测研究人群粪便基因SDC2、BMP3甲基化状态，以评价其在结直肠癌筛查中的应用价值，同时评价联合粪便基因SDC2和BMP3甲基化检测的诊断性能是否优于单一基因检测。

1 资料与方法

1.1 粪便样本收集

本研究选取广州医科大学附属市十二人民医院和中山大学附属肿瘤医院（以下简称“我院”）2019年5～9月收治的64例患者的粪便标本，包括肠癌组29例，腺瘤组9例，对照组26例。其中对照组包括非腺瘤性息肉（10例）、其他肠道病变（5例）、全大肠黏膜未见异常（10例）、神經内分泌肿瘤（1例）患者。在肠镜检查前或在手术前收集患者粪便，粪便在24 h内保存至-80℃冰箱。所有患者诊断均通过结肠镜检查或术后病理诊断，肠癌组病理诊断均为腺癌。根据第8版AJCC结直肠癌分期系统[15]对腺癌进行分期。所有患者术前均未接受化疗或放疗。本研究经我院医学伦理委员会批准，所有患者均签署知情同意书。

1.2 主要仪器设备及试剂

T100TMPCR仪、PowerPacTM基础电泳仪、Gel DocTM EZ System均购自BIO-RAD公司，QIAamp？誖Fast DNA Stool Mini Kit（163025619）、EpiTect？誖Bisulfite Kits（163017560）和EpiTect？誖 PCR Control DNA Set（1630 22382）均购自德国Qiagen公司，Premix TaqTM（Ex TaqTM Version 2.0）（AJ20771A）和TaKaRa EpiTaqTM HS（for bisulfite-treated DNA）（AIE1877A）购自宝日医生物技术有限公司，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司代为合成。

1.3 粪便DNA提取

所有粪便样本在处理前随机编码，使用粪便DNA提取试剂盒从粪便样本（180～220 mg）中提取基因组DNA，操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。

1.4 亚硫酸盐转化

为验证提取DNA的质量，针对人源β-actin基因进行PCR扩增。25 μL PCR反应体系包括：Premix Taq（Ex Taq Version 2.0）12.5 μL，引物β-actin-F（5′-TGGTGATGGAGGAGGCTCAGCAAGT-3′）和β-actin-R（5′-AGCCAATGGGACCTGCTCCTCCCTTGA-3′）各0.4 μmol/L，1 μL粪便DNA。PCR反应条件为：95℃，5 min，95℃，30 s;63℃，30 s;72℃，30 s;40次循环;72℃，10 min。若成功扩增出目的条带（133 bp），使用亚硫酸氢盐转化试剂盒将基因组DNA进行修饰，将未发生甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶，而甲基化的胞嘧啶保持不变。

1.5 MSP技术

转化后的DNA作为模板DNA用于后续MSP技术检测。25 μL PCR反应体系包括：TaKaRa EpiTaq HS（5 U/μL）0.125 μL，10×EpiTaq PCR Buffer（Mg2+ free）2.5 μL，25 mmol/L MgCl2 2.5 μL，dNTP Mixture 3 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL，模板DNA 2 μL。反应条件为：95℃，5 min;95℃，30 s;54～62℃，30 s;72℃，30 s;40个循环;72℃，10 min。EpiTect PCR Control DNA作为阳性对照，水作为阴性对照。扩增产物在3%琼脂糖凝胶中进行电泳分离，然后进行凝胶成像。甲基化检测结果判定标准：仅出现甲基化条带而不出现非甲基化条带或甲基化和非甲基化条带均出现视为甲基化;仅出现非甲基化条带而不出现甲基化条带视为非甲基化。判定联合检测结果阳性的标准是只要有一个基因甲基化阳性即判定该样本为阳性。引物序列见表1。

表1   SDC2和BMP3引物序列

注：M：甲基化;U：非甲基化;F：正义链;R：反义链。SDC2：黏结蛋白聚糖2;BMP3：骨形态发生蛋白3

1.6 统计学方法

采用SPSS 16.0和MedCalc 15.2统计软件对所得数据进行分析。计量资料以均值±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析。计数资料以例数或百分比表示，采用χ2检验或Fisher′s确切概率法。使用ROC曲线评价诊断试验的准确性，并计算曲线下面积（AUC）。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基本信息

肠癌组29例，其中男17例，女12例，平均年龄（57.7±13.7）岁;腺瘤组9例，男7例，女2例，平均年龄（61.1±12.2）岁;对照组26例，男11例，女15例，平均年龄（56.0±15.6）岁。三组患者性别、年龄比较，差异无统计学意义（P > 0.05），具有可比性。

2.2 粪便基因SDC2和BMP3联合检测与单基因检测比较

联合检测结直肠癌灵敏度高于BMP3单基因检测，差异有高度统计学意义（χ2 = 9.032，P < 0.01）;与SDC2单基因检测比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。联合检测腺瘤灵敏度与SDC2、BMP3单基因检测灵敏度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。联合检测结直肠癌和腺瘤灵敏度与SDC2、BMP3单基因检测比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图1、表2。

2.3 粪便基因SDC2、BMP3、联合检测诊断结直肠癌ROC曲线

SDC2基因（AUC = 0.751，95%CI：0.616～0.857）、BMP3基因（AUC = 0.686，95%CI：0.546～0.804）、联合检测诊断（AUC = 0.818，95%CI：0.690～0.909）结直肠癌的AUC值比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。联合检测AUC值高于BMP3检测，差异有统计学意义（Z = 2.361，P < 0.05）。联合检测AUC值与SDC2检测比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2。

2.4 肠癌组患者不同临床特征SDC2、BMP3甲基化阳性率比较

SDC2、BMP3、联合检测检出率在不同年龄、性别、肿瘤大小、TNM分期、分化程度比较，差异均无统计学意义（均P > 0.05）。SDC2对不同分布部位检出率比较，差异无统计学意义（P > 0.05），而BMP3、聯合检测检出率比较，差异有统计学意义（P < 0.05）。见表3。

3 讨论

理想的结直肠癌筛查方式应该具备简单、方便、人群依从性高等特点，更重要的是诊断性能高。无论是SDC2，还是BMP3，单一基因检测均能区分结直肠癌、腺瘤和对照患者;然而，单一基因检测结直肠癌的灵敏度偏低，容易遗漏较多肠癌患者。现阶段，局部浸润、区域侵犯、远处转移的结直肠癌患者5年生存率分别为90.0%、71.0%、14.0%[16]。因此，在筛查中需要提高发现Ⅰ～Ⅲ期直肠癌患者灵敏度，对这些患者的获益更大。联合检测诊断结直肠癌的灵敏度高于BMP3检测，差异有统计学意义（P < 0.05），同时保持较高的特异度;但是，当联合检测与SDC2检测灵敏度比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。本研究结果显示，联合检测优于BMP3检测，尚不能认为联合检测优于SDC2检测。若需证实粪便基因SDC2和BMP3联合检测优于SDC2基因检测，扩大样本量可能是一个可行的方式。

另外，本研究结果显示，所有近端结肠癌患者均未检测到BMP3基因甲基化，远端结直肠癌患者BMP3基因甲基化阳性率为56.5%。本研究中，BMP3基因甲基化检测容易遗漏近端结肠癌患者。然而，Loh等[10]发现，近端结直肠癌组织BMP3基因甲基化阳性率为79.3%，与远端结直肠癌组织阳性率（30.0%）比较，差异有高度统计学意义（P < 0.01）。除引物序列不同和基因组DNA来源不同外，本研究近端结直肠癌患者纳入例数较少，也是造成差异的重要原因。

以往研究显示[17]，粪便基因BMP3甲基化检测结直肠癌、进展期腺瘤灵敏度分别为40.0%、33.3%，特异度为85.0%，与本研究结果相似。若联合SFRP2、TFPI2、NDRG4、BMP3检测，则能提高检测结直肠癌、进展期腺瘤灵敏度。然而，特异度降至55.0%[17]。柏愚等[13]研究显示，联合粪便基因SDC2和SFRP2检测能够显著提高检测肠癌灵敏度。可见，多靶点检测是提高诊断结直肠癌灵敏度的有效方式，然而却降低了特异度。另外，Chen等[18]研究显示，联合粪便基因SEPT9、NDRG4、SDC2甲基化检测能改善单一基因检测的诊断效能低的不足，但联合粪便基因BMP3、SEPT9、NDRG4、SDC2甲基化检测并不能显著改善诊断准确度。Sun等[19]研究显示，联合粪便基因SDC2和SFRP2、KRAS突变和粪便潜血，检测CRC、腺瘤的灵敏度分别为91.4%、60.0%，特异度为86.1%。以上研究显示，多靶点粪便基因检测结直肠癌的诊断效能优于单一基因检测的诊断性能。多靶点粪便基因检测已于2016年被纳入美国预防服务工作组推荐的结直肠癌筛查方式[20]，但到目前为止，多靶点基因检测在国内尚处于探索阶段。增加1个或多个靶点检测增加了检测成本，从众多肿瘤标志物里筛选出符合国人特性的数个肿瘤标志物不是一件容易的事。因此，建立基于结直肠癌发生发展分子模型的多靶点检测应该是现阶段的研究方向。

本研究存在以下几点不足：首先，小样本量造成的分类偏差大，特别是腺瘤组;其次，疾病谱偏倚，所选的对照组不足以代表非结直肠癌、非腺瘤患者，还需纳入存在上消化道病变、炎症性肠病、肝癌等患者;最后，本研究并未独立进行粪便潜血检测，无法与粪便潜血检测的诊断性能做比较。

综上所述，联合粪便基因SDC2和BMP3甲基化检测结直肠癌的诊断性能优于BMP3检测，但与SDC2检测比较无明显改善。

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（收稿日期：2019-12-08  本文编辑：王晓晔）