siRNA干扰Annexin A7对宫颈癌细胞株Ki67和P16的影响

周星 陈雪 崔磊 孙吉瑞 张丙信 李艺萱 张金库

[摘要] 目的 探讨宫颈癌细胞株中膜联蛋白A7（Annexin A7）表达抑制后对Ki67和P16的影响。 方法 细胞培养后分成siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组进行小干扰RNA（siRNA）干扰，抑制宫颈癌细胞系Hela细胞Annexin A7的表达，蛋白印迹法鉴定其干扰效率后，应用激光共聚焦免疫荧光法检测Annexin A7表达抑制后对Hela细胞Ki67和P16表达的影响。 结果 干扰组Annexin A7的表达量与阴性对照组和空白对照组比较明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）;与阴性对照和空白对照组比较，Ki67阳性产物在siRNA干扰组明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05）;siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组P16阳性产物比较差异无统计学意义（P > 0.05）。结论 Annexin A7可能参与了宫颈癌细胞增殖功能的上调作用。

[关键词] 膜联蛋白A7;Ki67;P16;宫颈癌

[中图分类号] R737.33          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2020）04（b）-0012-03

Effect of siRNA interference Annexin A7 on cervical cancer cell lines Ki67 and P16

ZHOU Xing1   CHEN Xue1   CUI Lei2   SUN Jirui1   ZHANG Bingxin1   LI Yixuan1   ZHANG Jinku1▲

1.Department of Pathology， Baoding N0.1 Central Hospital， Hebei Province， Baoding   071000， China; 2.Department of Cardiovascular Medicine， the N0.2 Hospital of Baoding， Hebei Province， Baoding    071000， China

[Abstract] Objective To study the effect of Annexin A7 expression inhibition on Ki67 and P16 of Hela cells. Methods After cell culture， the cells were divided into the siRNA interference group， the negative control group and the blank control group for small interfering RNA （siRNA） interference to inhibit the expression of Annexin A7 in Hela cells of cervical cancer cell line. After the interference efficiency was identified by Western blot， the effect of the inhibition of Annexin A7 on the expression of Ki67 and P16 in Hela cells was detected by laser confocal immunofluorescence assay. Results Annexin A7 expression in the siRNA intervention group was significantly lower than that in the negative control group and the blank control group， with statistically significant difference （P < 0.05）. Compared with the negative control group and the blank control group， Ki67 positive products were significantly reduced in the siRNA interference group， and the difference was statistically significant （P < 0.05）. There was no statistically significant difference in P16 positive products among the siRNA interference group， the negative control group and the blank control group （P > 0.05）. Conclusion Annexin A7 may get involved in upregulated cell proliferation of squamous cell carcinoma of the cervix.

[Key words] Annexin A7; Ki67; P16; Cervical carcinoma

宮颈癌以鳞状细胞癌最为常见，其发生率位居女性恶性肿瘤第二位，尤以发展中国家更为常见，严重危害了女性的健康及生命[1]。研究发现人乳头瘤病毒（HPV）感染是导致宫颈癌发生的主要原因[2-3]，并引起Ki67和P16表达上调，因此，近年来Ki67和P16免疫标记已经越来越多地应用于宫颈癌的早期诊断[4-6]。本课题组报道过膜联蛋白A7（Annexin A7）在人子宫颈鳞癌组织中表达上调[7-8]。本研究使用小干扰RNA（siRNA）干扰技术抑制Annexin A7在宫颈癌细胞系Hela细胞中的表达，在免疫荧光染色后，应用激光共聚焦显微镜观察Ki67和P16的表达变化，探讨Annexin A7与两者的关系，为研究人宫颈鳞癌的发生发展机制及临床应用奠定基础。

1 材料与方法

1.1 仪器试剂及细胞株

共聚焦激光显微镜（Zeiss，LSM800）;化学发光及荧光影像分析仪（日本富士公司，FUJIFILM LAS4000）;Ki67和P16免疫荧光试剂盒购于上海生物工程股份有限公司（生产批号：E607238、ESK6322）;Annexin A7 siRNA试剂盒（美国Invitrogen公司产品，LipofectamineTM 2000）;宫颈癌细胞株Hela细胞来自河北医科大学医学遗传学教研室。

1.2 siRNA干扰效率的测定

将Hela细胞培养于25 mL的培养瓶中，DMEM培养基，10%胎牛血清，置入培养箱，37℃、5%CO2。转染前1 d种植细胞于6孔板中，密度为（1～2）×105/孔;250 μmol/L DMEM培养基中加30 pmol siRNA，250 μmol/L DMEM培养基中加5 μL Lipofectamine转染试剂，两者混合，轻轻混匀，室温静置约20 min;将细胞分成3组：siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组;吸掉6孔板中的DMEM培养基，无血清培养基轻柔清洗2次，每孔加DMEM培养基2 mL，混合物加至培养孔中，阴性对照组加入StealthRNAi Negative control;空白对照组仅加DMEM培养基，轻柔混匀;6 h后更换含10%胎牛血清的DMEM培养基，48 h后收集细胞免疫印迹（Western blot）鉴定siRNA抑制效果。

1.3 Ki67和P16免疫荧光检测

在6孔细胞培养板底放入无菌盖玻片，干扰48 h后倒掉DMEM培养基，加入4%多聚甲醛固定40 min，0.25%的Triton X-100透膜8 min。封闭1 h后，加Ki67或P16荧光一抗（Ki67，1∶200;P16，1∶300），4°C湿盒中孵育过夜，室温孵育1 h后，加酶标二抗（1∶200），DAPI复染后激光共聚焦显微镜观察，LSM510软件分析。Ki67和P16免疫阳性产物表达于细胞核。

1.4 统计学方法

采用SPSS 13.0统计软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较行SNK-q检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 siRNAR干扰效率的测定

Western blot结果显示：宫颈癌细胞株Hela细胞中Annexin A7在siRNA干扰组明显受到了抑制，其表达降低（图1）。siRNA干扰组Annexin A7表达量低于阴性对照组和空白对照组，差异有统计学意义（P < 0.05），而阴性对照组和空白对照组Annexin A7表达量比较差异无统计学意义（P > 0.05）。见表1。

A：siRNA干扰组;B：阴性对照组;C：空白对照组。siRNA：小干扰RNA;Annexin A7：膜联蛋白A7

图1   Hela细胞siRNA干扰48 h后Annexin A7的表达情况

2.2 免疫荧光激光共聚焦检测结果

Ki67及P16免疫荧光激光共聚焦结果显示：其阳性产物在siRNA干扰组、阴性对照组、空白对照组Hela细胞中均有表达，见图2～3。与阴性对照和空白对照组比较，Ki67阳性产物在siRNA干扰组明显减少，差异有统计学意义（P < 0.05），而空白对照组和阴性对照组Ki67阳性产物比较差异无统计学意义（P > 0.05）。三组P16阳性产物比较差异无统計学意义（P > 0.05）。见表2。

A：siRNA干扰组;B：阴性对照组;C：空白对照组。siRNA：小干扰RNA

图2   激光共聚焦细胞免疫荧光显示siRNA干扰48 h后Ki67在Hela细胞中的表达变化（400×）

A：siRNA干扰组;B：阴性对照组;C：空白对照组。siRNA：小干扰RNA

图3   siRNA干扰48 h后P16在Hela细胞中的表达情况（400×）

表2   Hela细胞siRNA干扰48 h后

Ki67和P16的表达（MOD，x±s，n = 9）

注：与阴性对照组比较，*P < 0.05;与空白对照组比较，#P < 0.05。MOD：平均光密度值;siRNA：小干扰RNA

3 讨论

Ki67是一种与细胞增殖相关的核抗原，表达于细胞周期的G1、S、G2和M期，与细胞的增殖活性的调控功能相关[9-10]。研究发现其在多种恶性肿瘤如乳腺癌、食管癌、肾细胞癌等均表达异常增高。相关学者[11-12]研究报道Ki67在宫颈病变中随着宫颈病变级别的升高而表达增加。P16是一种肿瘤抑制基因，参与调控细胞周期，通过阻断Rb基因的磷酸化，抑制细胞周期进程[13-14]。研究[15-18]显示，P16蛋白的表达在宫颈癌前病变及宫颈癌中随着疾病的进展，呈现逐渐增高的趋势。因此目前临床及病理中将Ki67和P16联合使用作为宫颈病变的生物学标记指标，对于辅助诊断、判断病情、评估发展等发挥重要作用。

Annexin A7是依赖钙离子的磷脂结合蛋白超家族成员，其在胞膜转运、信号转导及细胞分化发展等方面起到重要作用[19-20]，近年来研究发现Annexin A7在恶性肿瘤中如前列腺癌、乳腺癌、胃癌中其蛋白表达产生不同程度的变化[21-22]。本课题前期研究曾报道过Annexin A7在宫颈鳞癌中的表达呈上调现象[7-8]，为了进一步研究其发挥作用的机制，本研究培养宫颈癌细胞株Hela细胞，然后应用siRNA干扰技术降低了Annexin A7在细胞株中的表达，经过Western blot鉴定成功后，用免疫荧光法检测Hela细胞中Ki67和P16的表达变化。结果显示，当Annexin A7被干扰表达降低后，siRNA干扰组、阴性对照组和空白对照组Hela细胞的P16表达未发生明显改变。但是siRNA干扰组Hela细胞Ki67的表达与阴性对照组和空白对照组比较明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05）。推测Annexin A7基因与细胞增殖功能的调控可能具有某些关系，其可能参与细胞增殖功能的上调作用。然而恶性肿瘤的形成是极其复杂的过程，不但细胞内部各种基因蛋白参与调控，细胞外环境同样起到重要作用。目前本研究还存在一定的局限性，将在此基础上继续扩充试验，研究其可能机制，为宫颈癌的发生发展及临床应用提供实验数据。

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（收稿日期：2019-10-25  本文编辑：刘永巧）