大肠杆菌K88ac-ST1 -LTB 融合蛋白多价卵黄抗体的制备

许崇利， 许崇波， 林一民

（1.吉林化工学院 生物与食品工程学院，吉林 吉林132022； 2.重庆医药高等专科学校 医学技术学院，重庆401331；3.韶关学院 英东生命科学院，广东 韶关512005；4.重庆大学附属肿瘤医院 肿瘤转移与个体化诊治转化研究重庆市重点实验室，重庆400030）

新生仔猪腹泻是目前规模化养猪生产面临的主要难题之一，给养猪业带来了巨大的经济损失［1-2］.致病性大肠杆菌是造成新生仔猪和断奶仔猪腹泻的最重要病原，其中产肠毒素大肠杆菌（Enterotoxigenic Escherichia coil，ETEC）是最主要的致病菌，它包括黏着素和肠毒素2 种致病因子.黏着素具有良好的免疫原性，主要有K88、987P、K99和F41 等，黏着素使ETEC 黏着于肠黏膜上皮细胞从而使其发生病理性变化最终导致仔猪腹泻.肠毒素包括ST1、ST2耐热性肠毒素和LTA、LTB不耐热性肠毒素，其中ST1没有免疫原性，LTB无毒性［3-6］.为了更好地解决免疫效果，构建了大肠杆菌K88ac-ST1-LTB基因工程疫苗［7-8］.

虽然抗生素作为控制细菌感染的有效药物广泛应用于生产中，但抗生素的长期使用引起的耐药性问题和生产中超量使用抗生素的现象越来越突出，而且控制效果也并不乐观［9-10］.抗生素替代品的研究成为畜牧业发展的迫切需求.初生仔猪和早期断奶仔猪自身免疫功能的不成熟以及早期断奶应激引起的免疫抑制，是造成仔猪对ETEC 敏感性增高、抗病力下降、引发ETEC 感染性腹泻的主要因素.利用外源抗体为仔猪提供被动免疫，可有效预防和治疗肠道ETEC 感染引起的疾病，其中鸡卵黄抗体因其化学性质稳定、特异性抗体含量高、安全性好、易规模化生产等特点，越来越受到人们的关注，并有潜力开发为一类可替代抗生素的高效生物防治制剂［11-14］.为此，课题组以产蛋鸡为生物反应器，采用大肠杆菌K88ac-ST1-LTB基因工程疫苗作为抗原，研究开发引起新生仔猪腹泻的ETEC最主要致病因子（K88ac、ST、LT）的特异性卵黄抗体，为进一步研究开发出一种新型高效、可替代抗生素的防治新生仔猪大肠杆菌性腹泻的特异性卵黄抗体生物防治制剂打下坚实基础.

1 材料和方法

1.1 载体和菌株 BL21（DE3）（pETXKSL3）重组菌株由课题组构建，海兰蛋鸡和仔猪购自正大畜禽有限公司.

1.2 试剂 TaKaRa 质粒DNA小量纯化试剂盒购自TaKaRa 公司；限制性核酸内切酶NcoI、HindIII和IPTG购自TaKaRa公司；兔抗鸡IgG辣根过氧化物酶（HRP）购自北京索莱宝科技有限公司，卡那霉素购自Promega公司.

1.3 重组菌株BL21（DE3）（pETXKSL3）鉴定和Western blot 分析 按照TaKaRa 质粒DNA 小量纯化试剂盒说明书提取pETXKSL3 重组质粒，利用限制性核酸内切酶对重组质粒进行鉴定，鉴定正确后送TaKaRa公司进行测序.取5 mL LB培养基，质量浓度30 μg／mL 的Kan，按照质量分数2%接种BL21（DE3）（pETXKSL3）重组菌株，37 ℃ 200 r／min恒温培养12 ～16 h，转接至200 mL Kan 质量浓度为30 μg／mL的LB 培养基中37 ℃恒温培养，当OD600＝0.6 ～0.8 时加入IPTG 诱导剂，其浓度为1 mmol／L，37 ℃诱导4 h后，4 ℃12 000 r／min离心1 min，弃去培养基上清液，所得沉淀即为菌体，20 mL 50 mmol／L Tris·Cl -2 mmol／L EDTA 重新悬浮菌体，12 000 r／min 离心10 min，弃去上清液，10 mL 10 mmol／L Tris·Cl再次悬浮菌体并使用质量浓度为1 mg／mL 溶菌酶破碎菌体，2 mL Triton X-100混匀并于30 ℃条件下水浴15 min.超声波碎菌仪连续2 个10 s 破碎，12 000 r／min 离心15 min，收集所得沉淀进行SDS -PAGE 电泳分析和Western blotting鉴定［15］.

1.4 卵黄抗体的制备

1.4.1 蛋鸡的免疫 将购买的4 月龄海兰蛋鸡随机分为5 组，按照5∶ 1 的比例将抗原与弗氏完全佐剂均匀混合进行首次免疫，充分乳化后选取胸肌部位进行分点注射，第二次免疫和第三次免疫在首次免疫14 d和28 d后进行，3 次免疫的抗原质量浓度分别为0.4、0.6 和0.8 mg／mL，注射量为每只1 mL／每次，在第二次免疫7 d 后开始收集蛋并以免疫前鸡蛋和血清分别作为阴性对照.

1.4.2 卵黄抗体的提取纯化 采用水稀释-盐析法提取卵黄抗体，首先使用清水去除蛋壳表面的污

物，接着用质量分数0. 5%新洁尔灭浸泡20 ～30 min并晾干，无菌条件下使用蛋黄分离器分离蛋黄与蛋清，9 倍体积的蒸馏水对提取的卵黄液进行稀释并将pH值调至5.0 ～5.2，置于冰箱4 ℃过夜后收集上清液，滴加饱和（NH4）2SO4至质量分数为60%，6 000 r／min 4 ℃离心15 min 后弃去上清液，收集得到的高免卵黄抗体置于-20 ℃备用.

1.4.3 卵黄抗体的效价检测 采用间接ELISA对卵黄抗体效价进行检测，利用包被液将抗原稀释至质量浓度为3.0 μg／mL，酶标板4 ℃孵育过夜，弃去包被液洗板3 次，加入200 μL／孔封闭液37 ℃孵育2 h，洗板3 次，将卵黄抗体以1∶ 500 的比例进行稀释，按照100 μL／孔的量加入酶标板37 ℃孵育1 h，洗板3 次后加入兔抗鸡辣根过氧化物酶（HRP）标记抗体（1∶ 2 000），按照100 μL／孔的量加入酶标板37 ℃孵育15 min，50 μL／孔加入2 mol／L H2SO4终止反应，酶标仪450 nm波长测定吸光度值并记录［16］.

1.5 仔猪预防效果试验 在有仔猪大肠杆菌病患病史的猪场选取3 窝30 头健康仔猪，分为3 组每组10 头，1 ～2 组于出生2 h和6 h后口服制备的多价高免卵黄抗体，每次4 mL，对照组3 组未采取任何免疫预防措施，14 d后观察仔猪腹泻情况.

1.6 仔猪攻毒保护试验 将70 头健康的新生3 日龄仔猪按自然窝次分成7 组，每组10 头，1 ～5 组为试验组，50 头仔猪于出生4 h 和8 h 后分别口服多价高免卵黄抗体4 mL，对照6 ～7 组20 头不口服高免卵黄抗体.48 h后用8 株大肠杆菌混悬液进行口服攻毒实验，每头5 mL，含菌量为1 ×1012CFU／mL，观察仔猪发病与病死情况并进行病理检测.

2 结果

2.1 pETXKSL3 重组质粒酶切鉴定 试剂盒快速抽提pETXKSL3 重组质粒，经NcoI／HindIII 双酶切后进行质量分数为1.5%的琼脂糖凝胶电泳，结果表明目的基因830 bp 位于750 ～1 000 bp 之间，序列测序表明pETXKSL3 重组质粒含有目的基因且序列和阅读框架均正确（图1）.

2.2 K88ac-ST1-LTB融合蛋白SDS-PAGE分析和Western blot鉴定 BL21（DE3）（pETXKSL3）重组菌株经IPTG诱导剂诱导3 h 后，收集菌体并进行破碎处理，SDS - PAGE 分析表明K88ac - ST1-LTB融合蛋白在BL21（DE3）宿主菌中高效表达，目的蛋白占菌体总蛋白的质量分数为32%. Western blot鉴定证实K88ac -ST1-LTB融合蛋白能够被ST1单抗、K88ac和LTB抗体所识别（图2）.

图1 重组质粒pETXKSL3 酶切鉴定结果Fig. 1 Identification of the recombinant plasmid pETXKSL3 by enzyme digestion

图2 K88ac-ST1 -LTB融合蛋白的SDS-PAGE（A）和Western blot（B）鉴定Fig. 2 SDS-PAGE analysis（A）and Western blotting identification（B）of the K88ac-ST1 -LTB protein

2.3 卵黄抗体的纯化 采用水稀释-硫酸铵二次沉淀法纯化制备的多价高免卵黄抗体，其为澄清透明状，质量分数15% SDS-PAGE凝胶电泳分析表明在31 ku处有清晰的蛋白质条带且纯度较高（图3）.

图3 纯化的卵黄抗体SDS-PAGE分析Fig. 3 SDS-PAGE analysis of the purified egg yolk antibody

2.4 卵黄抗体效价检测 间接ELISA方法测定多价高免卵黄抗体效价，抗原包被质量浓度为3.0 μg／mL，加入稀释度为1∶ 2 000 的二抗后，检测结果显示水稀释-硫酸铵二次沉淀法提取的多价高免卵黄抗体效价为1∶ 13 200.

2.5 仔猪预防效果试验 试验组20 头仔猪口服制备的多价高免卵黄抗体14 d后均未发病，预防有效率为100%，对照组10 头有3 头发病并死亡.

2.6 仔猪攻毒保护试验 5 组仔猪进行攻毒保护试验后，试验组保护率为96%（48／50）（表1），剖检后组织学检查无病理变化，表明口服多价高免卵黄抗体具有很好的免疫预防效果.而对照组20 头仔猪全部发病并死亡且出现明显的临床症状，剖检后组织学检查发生病理变化.上述结果说明K88ac -ST1-LTB多价卵黄抗体对由ETEC 引起的新生仔猪腹泻具有很好的预防效果.

表1 仔猪攻毒保护试验结果Tab. 1 Piglet challenge test results

3 讨论

目前为止，针对仔猪黄痢和仔猪白痢的预防与治疗措施主要包括接种大肠杆菌多价疫苗以及注射抗生素［17-18］.但抗生素治疗由于缺乏有效的监管，往往造成抗生素使用不当，甚至出现抗生素滥用现象，而且长期使用抗生素也会引起耐药性问题，不断出现大肠杆菌耐药菌株从而影响治疗效果.另外，肉制品中超标的抗生素也会危害身体健康［19-20］.国内对于仔猪腹泻的免疫预防虽然取得了较好的效果，但商业化的疫苗往往只针对ETEC菌毛，尚未有针对肠毒素的疫苗且只产生体液免疫，而且即使疫苗预防在体内产生高水平的抗体，但对于已经侵入肠道内的致病菌仍不能抑制其复制释放毒素.另外，疫苗预防会有不同程度的副作用，甚至会产生炎症反应从而影响免疫效果.因此，探索研发替代抗生素更有效的预防和治疗措施变得尤为重要.

迄今为止对于仔猪腹泻治疗主要采用抗生素，但抗生素仅对细菌起到抗菌效果，对于肠毒素作用效果并不显著，而且大肠杆菌极易产生耐药性，长时间使用抗生素会导致滥用现象并产生耐药菌株.另外，抗生素在杀菌同时也会抑制肠道内正常的益生菌从而导致肠道内微生物菌群失衡，干扰消化吸收功能.卵黄抗体是从免疫禽蛋中提取出来的针对特定抗原的抗体，卵黄抗体因其稳定性好、耐酸碱、耐高温、易于制备及纯化等独有的特点从而得到很好的开发和应用.近年来，研究人员利用卵黄抗体治疗仔猪腹泻方面进行了大量研究，研究表明卵黄抗体能有效防制仔猪腹泻且不会产生耐药性，有望成为新型可替代抗生素的高效生物防治制剂.课题组以产蛋鸡为生物反应器，采用大肠杆菌K88ac -ST1-LTB基因工程疫苗作为抗原，研究开发引起新生仔猪腹泻的ETEC最主要致病因子（K88ac、ST、LT）的特异性卵黄抗体，为进一步研究开发出一种新型高效、可替代抗生素的防治新生仔猪大肠杆菌性腹泻的特异性卵黄抗体生物防治制剂打下坚实基础.