黄芥籽粕黄酮提取及其抗氧化活性

赵二劳 展俊岭 杨 洁 赵三虎

(忻州师范学院化学系， 忻州 034000)

黄芥籽为十字花科芸薹属植物芥菜型油菜黄芥(BrassicajunceaL.)的籽粒，我国主产于晋北、陕北、内蒙、甘肃和青海等黄土高原地区，资源丰富[1]。黄芥籽颗粒较小，千粒质量2.0～2.6 g，亩产可达100～150 kg，种植效益较好。其皮壳为黄色或棕黄至棕红色，具有皮薄、色素少、含油量高以及纤维素含量低等优点[2-3]。目前，黄芥籽主要用于榨油，榨油后产生大量的副产品黄芥籽粕，多用作农肥或饲料，未进行精深加工，科技附加值低下，利用效益不高，造成资源的极大浪费。黄芥籽粕含有多糖、多酚及黄酮等功能活性成分，具有多种功能活性，在食品、医药、保健品等领域应用前景较好[4-7]。因此，研究黄芥籽粕中多糖、多酚及黄酮等功能成分的提取及其生物活性，对于提高黄芥籽粕科技附加值，有效拉长黄芥产业链，促进黄芥产业的发展，提升黄芥籽综合利用效益和经济价值，具有重要的实际意义。

目前，本课题组已就黄芥籽粕中多糖和多酚的提取及其一些功能活性进行了研究[1,8]，但有关黄芥籽粕中黄酮的提取鲜见相关研究报道。同时基于超声辅助提取技术的优势[9-10]，本实验研究黄芥籽粕中黄酮的超声辅助提取，通过单因素实验结合响应面分析的方法优化提取工艺，并采用清除DPPH·和·OH法测定其抗氧化活性，以期为黄芥籽粕中黄酮的提取及黄芥籽粕的高值化综合开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

黄芥籽粕(粉碎过40目筛，经石油醚脱脂后，烘干，保存备用)；芦丁标准品、1,1-二苯基-2-苦肼基(DPPH·)、2,6-二叔丁基对甲酚 (BHT)、无水乙醇、水杨酸、30%过氧化氢、硫酸亚铁、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠等试剂均为分析纯；实验用水为二次去离子水。

1.2 仪器与设备

723型可见分光光度计；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器；SHZ-2D循环水式真空泵。

1.3 方法

1.3.1 黄芥籽粕黄酮的超声辅助提取

工艺流程：预处理后黄芥籽粕粉→加入乙醇→超声辅助提取→过滤→滤液定容→提取液。

主要工艺参数：预处理后黄芥籽粕粉2.0 g，提取次数1次，过滤后提取液均定容为100 mL，其余工艺参数按实验设计。

1.3.2 黄芥籽粕中黄酮得率的测定1.3.2.1 标准曲线绘制

采用亚硝酸钠-硝酸铝比色法测定[11-12]。在最大波长510 nm处测定不同浓度芦丁标准品溶液吸光度，以芦丁质量浓度(C，μg/mL)为横坐标，相应吸光度值(A)为纵坐标，绘制标准曲线，得标准曲线回归方程：A= 0.011 9C+0.003，R2=0.999 5，芦丁质量浓度C的线性范围为0～72μg/mL。

1.3.2.2 黄芥籽粕黄酮提取得率的测定

准确量取黄芥籽粕提取液3.0 mL，置于25 mL比色管中，按1.3.2.1的方法测定并计算提取液中黄酮质量，按公式计算黄芥籽粕黄酮提取得率。

黄芥籽粕黄酮得率 = 提取黄酮质量(mg)/黄芥籽粕质量(g)

1.3.3 黄芥籽粕黄酮抗氧化活性

以清除DPPH·和·OH的IC50值为指标，用抗氧化剂2,6-二叔丁基对甲酚(BHT)为阳性对照，评价黄芥籽粕黄酮的抗氧化活性，IC50值越小，则其抗氧化活性越强。

1.3.3.1 黄芥籽粕黄酮对DPPH·的清除率

参考文献[1,13]的方法稍作改动，准确量取6份1.0 mL质量浓度为0.1 mg/mL的DPPH·溶液(无水乙醇配制)，分别置于10 mL比色管中，分别加入不同质量浓度的黄芥籽粕黄酮提取液，以体积分数70%乙醇定容至刻度，充分摇匀，在室温下，避光反应30 min后，在波长517 nm 处分别测定其吸光度，按公式计算清除率。

清除率= [1-(A1-A2)/A0]×100%

式中：A1为DPPH·溶液与一定黄芥籽粕黄酮溶液的吸光度；A2为仅黄芥籽粕黄酮溶液体系的吸光度，A0为仅DPPH·溶液体系的吸光度。

同法测定并计算BHT溶液的清除率。然后分别作黄芥籽粕黄酮和BHT溶液对DPPH·清除率曲线，对曲线线性回归计算其IC50值，比较其抗氧化活性。

1.3.3.2 黄芥籽粕黄酮对·OH的清除率

参考文献[1,14]的方法稍作改动， 在10 mL的比色管中，分别加入1.0 mL浓度为1×10-3mol/L的FeSO4溶液、1.0 mL浓度为1×10-3mol/L的水杨酸溶液和1.0 mL浓度为0.1% H2O2溶液，再加入一定浓度的黄芥籽粕黄酮或BHT溶液，用体积分数70%乙醇定容至刻度， 40 ℃恒温反应40 min后，于最大波长510 nm处测定其吸光度，按公式计算清除率。

清除率= [1-(Ai-Aj)/Ax]×100%

式中：Ax为不加黄芥籽粕黄酮或BHT溶液体系的吸光度；Ai加入黄芥籽粕黄酮或BHT溶液体系的吸光度；Aj仅黄芥籽粕黄酮或BHT溶液体系的吸光度。

分别作黄芥籽粕黄酮和BHT溶液对·OH清除率曲线，对曲线线性回归计算其IC50值，比较其抗氧化活性。

1.4 数据处理

本实验所有数值均为3次重复实验的平均值。数据间P<0.01为差异极显著，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

单因素实验结果如图1。由图1可知，固定超声功率240 W、提取温度40 ℃、料液比(g/mL)1∶20、提取时间30 min，当乙醇体积分数分别为30%、40%、50%、60%、70%、80%时，随乙醇体积分数增加，黄芥籽粕中黄酮得率先增大后降低，在乙醇体积分数为70%时，黄酮得率达到最大值8.89 mg/g，再继续增大乙醇体积分数，黄酮得率下降。其原因可能是乙醇体积分数过高，会增加黄芥籽粕中其他醇溶性物质溶出，影响黄酮类成分的溶出，导致黄芥籽粕黄酮得率降低[11]，因此，选择乙醇体积分数为70%。

固定超声功率240 W、提取温度40 ℃、乙醇体积分数为40%、提取时间为30 min，料液比(g/mL)分别为1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30时，随料液比的增加，黄芥籽粕黄酮得率呈先增加后降低的趋势。在料液比为1∶15(g/mL)时，黄芥籽粕中黄酮得率达到最大，为9.38 mg/g，之后随料液比的增加，黄酮得率逐渐减小。可能原因是溶剂量的增加，有利于黄酮类成分的溶解及增大了溶液的传质推动力，使黄酮得率增加；但料液比继续增加，一方面影响超声波辐射对黄芥籽粕作用的效率[1]，另一方面会增加一些其他成分溶出，影响黄酮类成分溶出[15，16]，导致黄酮得率下降，因此，选择料液比(g/mL)为1∶15。

固定超声功率240 W、乙醇体积分数为40%、料液比(g/mL)1∶20、提取温度40 ℃，提取时间分别为10、20、30、40、50、60 min时，随提取时间的增加，黄芥籽粕黄酮得率缓慢增加，当提取时间为40 min时，黄酮得率达最大，为7.84 mg/g。以后随提取时间的增加，黄酮得率下降。其原因可能是提取时间短，黄酮提取不充分；提取时间过长，在超声波的作用下，会破坏黄酮的结构，使黄酮得率下降[16]。因此，选择提取时间为40 min。

固定乙醇体积分数为40%、料液比(g/mL)1∶20、提取温度40 ℃、提取时间30 min，超声功率分别为160、200、240、280、320、360 W时，随超声功率的增大，黄芥籽粕黄酮得率呈先增后降趋势，但总体变化不大，在超声功率为280 W时，黄酮得率达最大，为9.24 mg/g。因此确定超声功率为280 W。

固定超声功率240 W、乙醇体积分数为40%、料液比(g/mL)1∶20，提取时间30 min，提取温度分别为20、30、40、50、60、70 ℃时，随提取温度升高，黄芥籽粕黄酮得率呈先增后降趋势，当提取温度为30 ℃时，黄芥籽粕黄酮得率达最大，为8.79 mg/g。黄酮得率逐渐下降，但变化不大。考虑能耗等问题[11]，确定提取温度为30 ℃。

图1 超声辅助提取黄芥籽粕黄酮单因素实验

2.2 响应面实验

根据单因素实验结果，固定超声功率280 W、提取温度30 ℃，选取对黄芥籽粕黄酮提取得率影响较大的乙醇体积分数(A)、料液比(B)和提取时间(C)为因素，以黄酮提取得率(Y)为响应值，进行三因素三水平的响应面分析，确定黄芥籽粕黄酮超声辅助提取的最佳工艺。因素与水平见表1，响应面设计及结果见表2。

表1 因素与水平

表2 响应面实验设计及结果

利用Design Expert 8.0.6 软件对表2数据进行回归分析，得到黄芥籽粕黄酮得率对各因素的二次多项回归方程为：Y=10.09+0.11A+0.18B+0.38C-0.30AB+0.08AC+0.07BC-0.34A2-0.33B2-2.14C2。对该回归方程进行方差分析，结果见表3。

表3 回归方程的方差分析

注：P<0.01为差异极显著；P<0.05为差异显著。

2.3 验证实验

通过Design- Expert 8.0.6 软件对回归模型分析，得到黄芥籽粕黄酮超声辅助提取最佳工艺条件为：固定超声功率280 W、提取温度为30 ℃时，乙醇体积分数70.57%，料液比(g/mL)1∶16.28，提取时间40.94 min。此工艺条件下，黄芥籽粕黄酮理论得率为10.134 mg/g。进行验证实验考查实验结果的可靠性，为了实验操作便利，将工艺条件修正为：固定超声功率280 W、提取温度为30 ℃，乙醇体积分数为71%，料液比(g/mL)1∶16，提取时间41 min，进行3次平行验证实验，黄芥籽粕黄酮平均得率为10.042 mg/g，与理论预测值的相对误差为0.91%，表明响应面法优化的黄芥籽粕黄酮超声辅助提取工艺稳定可靠。

2.4 黄芥籽粕黄酮抗氧化活性

2.4.1 黄芥籽粕黄酮对DPPH·的清除率

黄芥籽粕中黄酮类成分对DPPH·的清除结果如图2所示。在浓度范围内，黄芥籽粕黄酮提取液和BHT溶液对DPPH·的清除率都随其浓度的增加而增大，量效关系明显。分别对其清除率曲线进行线性回归，计算得黄芥籽粕黄酮与BHT清除DPPH·的IC50分别为3.80、6.21 μg/mL，可见，黄芥籽粕黄酮对DPPH·的清除能力强于常用抗氧化剂BHT，表明黄芥籽粕黄酮具有较强的DPPH·清除能力，即具有强的抗氧化活性。

图2 黄芥籽粕黄酮和BHT对DPPH·的清除率

2.4.2 黄芥籽粕黄酮对·OH的清除率

黄芥籽粕中黄酮类成分对·OH的清除结果如图3所示。可以看出，在实验浓度范围内，黄芥籽粕黄酮提取液和BHT溶液对·OH的清除率都随其浓度的增加而增大，也具有明显的量效关系。分别对其清除率曲线进行线性回归，计算得黄芥籽粕黄酮与BHT清除·OH的IC50分别为2.18 μg/mL和5.87 μg/mL，显见，黄芥籽粕黄酮对·OH的清除能力强于常用抗氧化剂BHT，表明黄芥籽粕黄酮具有强的·OH清除能力，即黄芥籽粕黄酮具有较强的抗氧化活性。

图3 黄芥籽粕黄酮和BHT对·OH的清除率

3 结论

本研究优化了黄芥籽粕中黄酮超声辅助提取工艺，并采用清除DPPH·和·OH法测定了黄芥籽粕黄酮抗氧化活性。影响黄芥籽粕黄酮超声辅助提取得率的因素大小顺序为：提取时间>料液比>乙醇体积分数。确定的黄芥籽粕黄酮超声辅助提取最佳工艺条件为：乙醇体积分数71%，料液比(g/mL)1∶16，超声功率280 W、提取温度30 ℃，提取时间41 min。在此工艺条件下，黄芥籽粕黄酮得率为10.042 mg/g，与理论预测值10.134 mg/g的相对误差为0.91%。黄芥籽粕黄酮与BHT清除DPPH·的IC50分别为3.80 μg/mL和6.21 μg/mL；清除·OH的IC50分别为2.18、5.87 μg/mL。表明响应面法优化的黄芥籽粕黄酮超声辅助提取工艺稳定可行，黄芥籽粕黄酮具有强的抗氧化活性，可作为天然抗氧化剂开发应用。