SIRT1/TLR4/NF-κB在丹参素治疗大鼠心肌梗死的保护作用

韩晓娟，陈礴，侯海文

急性心肌梗死（AMI）是冠状动脉闭塞或严重狭窄导致大量心肌细胞急剧缺血、缺氧引发细胞坏死的疾病，该病发病急，病情重，病情变化快，严重影响患者的生命健康与生活质量，AMI已成为我国居民首位死因[1-3]。AMI再灌注治疗后，患者极易并发心肌缺血再灌注损伤及心室重构，严重影响了AMI患者的临床治疗疗效及患者的预后。研究表明，心肌细胞凋亡是AMI及心肌缺血再灌注损伤的一个重要病理改变[4]。丹参素（Danshensu）是丹参中的主要有效成分，是已被证实的治疗冠心病的重要活性成分[5]。丹参素具有扩张血管，增加冠状动脉血流量，增强组织抗缺氧能力，减轻炎症反应等作用。丹参素可改善心肌缺血再灌注后的心脏功能障碍，缩小心肌梗死面积，研究表明，丹参素在急性脑梗死、冠心病及心绞痛等治疗中具有显著作用[6]。通过本研究通过给予丹参素治疗心肌梗死大鼠，以探讨丹参素对AMI心肌损伤的保护作用，为临床治疗急性心肌梗死提供新的思路和参考。

1 材料与方法

1.1 心肌梗死大鼠模型的建立清洁级健康SD大鼠，45只，雄性，体重220～260 g，购自第四军医大学实验动物中心，动物许可证号：SCXK（陕）2014-002。已通过我院动物实验伦理审查。在腹腔行10%的水合氯醛，0.3 ml/100 g水合氯醛、吗啡（6 mg/kg，皮下注射）麻醉大鼠。在大鼠胸部正中偏左侧切口露出大鼠心脏，在左心耳与肺动脉圆锥之间，以5-0无创缝合线穿过前降支（LAD）并结扎。观察心电图，心电图Ⅱ导联ST段明显升高， 肉眼观察结扎区域变白作为模型成功的标志，实验过程中维持机械呼吸支持。心脏复位关胸，然后缝合皮肤。

SD大鼠造模成功24 h后，丹参素组给予经尾静脉注射2 mg/kg丹参素注射液，连续7 d；对照组和模型组给予等剂量生理盐水。

1.2 心肌梗死组织形态学检查HE染色检测：取大鼠心肌组织石蜡切片标本（5 μm/张）常规进行苏木精和伊红液染色，观察HE染色大鼠心肌病理改变结果。

心肌梗死面积检测：取大鼠心肌组织冰冻切片，置于2% TTC 37℃孵育15 min，用多聚甲醛固定后进行数码相机拍照 用Image ProPlus图像分析系统测量各组大鼠心肌梗死面积，梗死面积（%）＝ 梗死区 /（梗死区＋缺血区）×100%。TTC染色后，白色区域代表心肌梗死区（AN），红色区域代表心肌缺血，蓝色区域代表正常区。

1.3 免疫组织化学法染色取鼠心肌组织石蜡切片标本（5 μm/张），加入5%血清进行室温封闭（40 min），加入一抗SIRT1和二抗孵育。清洗后加入SP和DAB试剂盒。封片后用显微镜进行观察。SIRT1阳性表达表现：在心肌细胞内出现棕黄色颗粒。

1.4 ELISA法检测IL-6 和 TNF-α表达离心大鼠心肌组织提取蛋白，采用ELISA法测定大鼠心肌组织TNF-α和IL-6的含量，试剂盒购于美国R&D公司。

1.5 WesternBlot检测SIRT1、TLR4、NF-κB、Bcl-2、Caspase3蛋白表达水平离心大鼠心肌组织提取蛋白（蛋白浓度总量为30 μg/μl）。各组大鼠心肌组织蛋白样品常规进行凝胶电泳和转膜，加入大鼠多克隆抗体SIRT1、TLR4、NFκB、Bcl-2、Caspase3和二抗。显色使用ECL显色剂，用Quantity-one软件进行蛋白分析。以目的条带与内参β-actin 条带灰度值比值评定蛋白表达水平。

1.6 统计学处理采用SPSS 22.0软件进行数据处理，计量资料结果用均数±标准差表示，组间差异采用单因素方差分析和t检验，以P＜0.05为差异，具有统计学意义。

2 结果

2.1 HE染色结果光镜下可见心肌细胞形态学特征基本正常，心肌纤维排列整齐匀称，偶有少量炎症细胞浸润。模型组可见心肌纤维结构破坏、排列紊乱，心肌纤维增粗、纤维组织广泛增生；大量心肌细胞核浓缩、变小或变性，心肌间质充血、水肿，可见大量心肌坏死灶及炎性细胞浸润等。丹参素组可见心肌纤维增粗、心肌纤维排列相对整齐，心肌细胞较少量的变性、心肌组织水肿恢复，炎症细胞浸润减少，病变程度逐渐恢复（图1）。

图1 HE染色结果（×20）

2.2 免疫组化染色结果与对照组大鼠SIRT1表达平均光密度相比，模型组SIRT1表达平均光密度显著降低，丹参素组显著升高（P＜0.05）。与模型组相比，丹参素组SIRT1表达平均光密度显著升高（P＜0.05）（图2）。

图2 免疫组化染色结果（×20）

2.3 心肌梗死面积测定与对照组大鼠心肌梗死面积相比，模型组和丹参素组大鼠心肌梗死面积显著增大（P＜0.05）。丹参素组大鼠心肌梗死面积比模型组显著减少（P＜0.05）（图3）。

图3 心肌梗死面积测定

2.4 ELISA测定IL-6 和 TNF-α表达与对照组大鼠心肌梗死面积相比，模型组和丹参素组大鼠IL-6 和 TNF-α表达显著增多（P＜0.05）。与模型组相比，丹参素组IL-6 和 TNF-α表达显著降低（P＜0.05）（图4）。

图4 ELISA 测定IL-6和TNF-α表达

2.5 蛋白表达水平测定与对照组相比，模型组和丹参素组大鼠TLR4、NF-κB、Caspase3蛋白表达明显上升，SIRT1、Bcl-2蛋白含量下降（P＜0.05）；与模型组相比，丹参素组TLR4、NFκB、Caspase3蛋白表达明显下降，SIRT1、Bcl-2蛋白含量表达比模型组显著上升（P＜0.05）。（图5）。

图5 蛋白表达水平测定

3 讨论

丹参素是丹参治疗冠心病的重要活性成分，具有扩张血管，增加冠状动脉血流量，增强组织抗缺氧能力，减轻炎症反应等心肌保护作用[7]。卫国等[5]建立心肌梗死模型大鼠，给予丹参素治疗后，发现大鼠心功能明显改善，心肌梗死面积减少，认为丹参素可以明显减轻心肌梗死大鼠的心肌损伤，其机制可能与丹参素上调血管内皮生长因子、基质细胞衍生因子-1、CXC趋化因子受体4等蛋白表达从而促进缺血心肌的血管新生有关。本研究结果表明，光镜下模型组可见心肌纤维增粗、心肌纤维结构破坏、排列紊乱；大量心肌细胞变小或变性，心肌间质充血、水肿及炎性细胞浸润等。研究表明，丹参素可有效改善大鼠心肌梗死，抑制心肌细胞的凋亡；丹参素组大鼠心肌梗死面积显著减少，丹参素可显著减少大鼠心肌梗死面积和心肌细胞的死亡。同时，丹参素组大鼠可见心肌纤维增粗、心肌纤维排列相对整齐，心肌细胞较少量的变性、心肌组织水肿恢复，炎症细胞浸润减少，病变程度逐渐恢复。

沉默信息调节因子1（SIRT1）是一种辅酶Ⅰ依赖性的去乙酰化酶，具有高度保守性[8]，参与调节细胞内DNA修复、细胞增殖、炎症反应、氧化应激等机体生理病理过程[9，10]。研究表明，SIRT1是公认的抗冠状动脉粥样硬化因子，其可能通过抑制ox-LDL表达来引导细胞凋亡，促进内皮性NO的表达和释放， 其是参与调节细胞氧化应激及炎症反应的关键酶，能明显减轻炎症反应和氧化应激作用[11]。本研究结果表明，丹参素可有效提高心肌组织内SIRT1表达，减轻心肌细胞凋亡及心肌纤维化。SIRT1可调节P53、MyoD、FOXO3以及NF-kB来介导应激时细胞防御和生存，是一种与细胞的代谢状态密切相关的重要调节器[12]。本研究结果表明，丹参素促进SIRT1表达后，丹参素组TLR4、NF-κB、Caspase3蛋白表达明显下降，SIRT1、Bcl-2蛋白含量表达比模型组显著上升，说明丹参素是通过抑制炎症信号通路TLR4/NF-κB信号通路来改善大鼠心肌梗死，显著减少大鼠血清中TNF-α和IL-6 等炎症因子的生成和释放，抑制心肌组织内的免疫反应、炎症反应，促进心肌细胞的增殖和发育，显著改善心肌组织的坏死情况。

综上所述，丹参素可通过促进SIRT1表达，抑制TLR4/NF-κB信号通路来改善大鼠心肌梗死，抑制心肌纤维化，对心肌起到营养和保护的作用改善心功能。本结果证实丹参素具有心肌保护作用，为明确现代中药新药的药理机制奠定了基础。