MAPKs通路磷酸化激活在扩张型心肌病患者心肌纤维化中的临床意义

周易，刘畅，易欣，蒋学俊

扩张型心肌病（DCM）是指在心脏无异常压力负荷或冠状动脉（冠脉）疾病等其他心脏疾病的情况下，出现的以左心室或双心室扩大并伴有心脏舒张、收缩功能障碍的一类疾病，是临床上出现进展性心力衰竭和心源性猝死的主要原因[1，2]。心室重构是DCM的主要病理改变，包括心肌细胞不规则肥大和心肌纤维化[3]。研究发现丝裂原活化蛋白激酶（MAPKs）信号通路参与调控真核细胞内许多重要生理活动，涉及细胞增殖、分化和凋亡等[4]。研究发现，MAPKs信号通路与压力负荷过大或心肌缺血所致的心肌纤维化密切相关。因此，本研究拟通过检测DCM临床心肌组织样本中MAPKs信号通路分子的总蛋白及磷酸化水平，以及其下游分子早期生长反应因子（EGR-1）的表达水平，探讨MAPKs信号通路激活在DCM患者心肌纤维化中的临床意义。

1 资料与方法

1.1 研究对象收集DCM患者接受心脏移植者受体心脏6例（DCM组），并选择移植失败的供体心脏6例作为对照组。DCM的诊断标准参照2006年美国AHA制定的DCM诊断标准，即左心室舒张末期内径＞55 mm、左心室射血分数（LVEF）＜45%或左心室缩短速率＜25%[5]。排除冠状动脉性心脏病、先天性心脏病、高血压、自身免疫性疾病等可以引起心脏扩张的心血管疾病和全身性疾病。同时，收集DCM患者一般临床资料，包括年龄、性别、左心房内径（LAD）、右心房内径（RAD）、左心室内径（LVD）、右心室内径（RVD）、室间隔厚度（IVSD）、LVEF。

1.2 研究方法

1.2.1 标本收集收集DCM患者受体心脏及移植失败的供体心脏的左心室肌组织。切取离体心脏的左心室肌组织，生理盐水冲洗后，分为两份。一份立即放入冻存管于液氮中迅速冷冻后-80℃冰箱中保存，用于Western Blot检测；另一份置于4%多聚甲醛中固定，制作病理石蜡切片，后续染色观察。

1.2.2 Western Blot法检测心室肌组织中MAPKs信号通路分子的磷酸化水平Western blot法测定两组心室肌组织中MAPKs信号通路分子MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38 的总水平和磷酸化水平、以及下游分子EGR-1的蛋白表达水平。心室肌组织研磨后加入新鲜配制的蛋白裂解液提取总蛋白，BCA试剂盒测定各样品的蛋白浓度，将各样品蛋白浓度调整一致，与上样缓冲液混合，加热煮沸10 min，使蛋白充分变性，并分装保存在-80℃。蛋白溶解后，行SDS-PAGE凝胶电泳，再4℃下转膜，PVDF膜在5%脱脂奶粉中封闭2 h，分别加入抗MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38、p-MEK1/2、p-ERK1/2、p-JNK1/2、p-P38、EGR-1、GAPDH一抗，4℃孵育过夜。次日，二抗孵育2 h，显影。以GAPDH为内参，测定目标条带及GAPDH的灰度值，两者灰度值比值为目的蛋白的相对表达水平。

1.2.3 苏木精-伊红染色（HE染色）4%多聚甲醛固定后的心室肌组织，经脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等步骤制成石蜡切片。石蜡切片依次经二甲苯脱蜡、下行梯度酒精脱苯、水洗、苏木素染色、0.1%盐酸酒精分化、Scott液返蓝、伊红染色、上行梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片；最后，显微镜下观察心肌组织的形态结构及排列特点。

1.2.4 苦味酸-天狼星红染色（PSR染色）制备好的石蜡切片常规脱蜡、脱水后，依次经磷钼酸染色、0.1%苦味酸天狼星红染色、0.01N盐酸分化、上行梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树脂封片；最后，光学显微镜下观察心肌组织中红色胶原纤维的分布情况，拍照并计算胶原容积百分比（CVF），CVF=胶原面积/图像面积×100%。

1.3 统计学处理计量资料数据采用均数±标准差表示。采用SPSS 19.0软件，进行数据统计分析。两组间比较采用两独立样本t检验，以P＜0.05为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 一般临床资料DCM患者和对照组年龄、性别差异无统计学意义（P＞0.05）。DCM患者超声心动图检查提示心室扩大，左心室扩张更为显著（69.83±14.71 mm），呈离心性扩张；心肌室壁运动幅度普遍减低，左室射血分数明显下降（26.83±8.49%）。

2.2 DCM患者心肌组织学病理改变与对照组相比，HE染色见DCM组心肌组织内心肌细胞不同程度肥大，胞浆内少许空泡形成；心肌细胞排列紊乱，周围间质组织纤维化明显（图1A）。PSR染色可见DCM组心肌组织间质内大量增粗的、亮红色胶原纤维沉积，呈弥漫性分布，CVF较对照组显著升高，差异具有统计学意义（P＜0.05）（图1B和1C）。以上提示，DCM患者心肌纤维化、心室重构明显。

2.3 DCM患者心肌组织MAPKs信号通路分子的总蛋白及磷酸化水平Western Blot结果显示，两组间MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38的总蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与对照组相比，DCM组心肌组织内MEK1 /2、ERK1/2、JNK1/2、P38 的磷酸化水平均明显增高（P＜0.05），差异具有统计学意义（图2）。

2.4 MAPKs信号通路下游分子EGR-1的蛋白表达水平Western Blot结果显示，与对照组相比，DCM组心肌组织内MAPKs信号通路下游分子EGR-1的蛋白表达水平明显增高（P＜0.05），差异具有统计学意义（图3）。

3 讨论

目前，DCM临床治疗大多基于血管紧张素转化酶抑制剂、血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂、β受体阻滞剂等药物，通过减慢心率、减缓心室重构等改善DCM患者的预后，心脏移植是终末期DCM患者最佳的治疗手段[6]。研究表明，心肌纤维化是DCM的主要特征，细胞外基质内大量胶原蛋白沉积；这些胶原蛋白主要由心脏成纤维细胞（CFs）合成，正常心肌中I型胶原蛋白（Col Ⅰ）与Ⅲ型胶原蛋白（Col Ⅲ）的比例相对恒定，心肌纤维化时心肌组织中ColⅠ与Col Ⅲ的比例升高[7，8]。因此，减轻甚至逆转心肌纤维化，是目前DCM治疗研究的新方向[9]。本研究发现，DCM患者心肌组织中ColⅠ、Col Ⅲ的表达增加，CVF明显升高，与既往研究类似。

图1 对照组和DCM组心室肌组织的病理学改变[A和B为对照组和DCM组患者心室肌组织HE染色及PSR染色结果（HE染色×40，PSR染色×20；PSR染色中黄色为心肌组织，红色为胶原纤维），C为对照组和DCM组患者心室肌组织的CVF。与对照组相比，P＜0.05]

图2 对照组和DCM组患者心肌组织中MEK1 /2、ERK1 /2、JNK1/2、P38的总蛋白及磷酸化水平（与对照组相比，**P＜0.01，***P＜0.001）

图3 对照组和DCM组患者心肌组织中EGR-1的蛋白表达水平（与对照组比较，**P＜0.01）

MAPKs信号通路是真核细胞介导细胞外信号到细胞内反应的信号转导系统的重要成员，通过MAPKK激酶（MAPKKK/MEKK）、MAPK激酶（MAPKK/MEK）和MAPK的级联模式传导细胞外信号，依次磷酸化激活将上游信号传递至下游应答分子，参与调控细胞增殖、分化、迁移、凋亡、炎症和纤维化修复等生物学过程[10，11]。在哺乳动物中，研究较为广泛的MAPKs信号通路是细胞外信号调节激酶（ERK）、c-Jun N-末端激酶（JNK）/应激活化蛋白激酶（SAPK）和P38 丝裂原活化蛋白激酶（P38 mitogen-activated protein kinase）信号通路[12-14]。Chang等[15]利用促炎因子IL-17对兔缺血性心力衰竭模型进行处理，心肌组织内p-P38 、p-JNK、p-ERK1/2及其下游靶蛋白IL-6、TNF、CCL20、CXCL1的表达水平升高，促进心肌细胞炎症、凋亡、纤维化进程，最终导致心室重构。此外，RAS-RAF-MEK1/2-ERK1/2通路的激活可促进CFs的增殖、促进心肌组织间质内胶原沉积，加速心肌纤维化的进展；而ERK1/2抑制剂可显著抑制CFs增殖、胶原蛋白合成及纤维化相关基因的表达，最终减轻心肌纤维化[16-18]。部分临床前研究发现P38通路在缺血性心脏病、心肌梗死和动脉粥样硬化中发挥重要作用[19]。本研究发现，DCM患者心肌组织中MAPKs信号通路分子MEK1/2、ERK1/2、JNK1/2、P38的磷酸化水平也增高，尤以MEK1/2、ERK1/2的磷酸化水平升高最为显著，以上结果表明MAPKs信号通路的磷酸化激活可能对DCM心肌纤维化、心室重构发挥促进作用。

早期生长反应因子（EGR-1），最早被认为是一种肿瘤抑制因子，在细胞生长、分化和存活中发挥作用，后发现其在免疫应答的启动过程中也发挥重要作用，是生长因子介导纤维化的核心转录因子[20]。EGR-1可作为ERK1/2通路的下游调控分子，γ-谷维素可清除活性氧参与抑制ERK1/2通路，从而抑制EGR-1的表达[21]。EGR-1可与启动子结合上调骨桥蛋白（OPN），OPN又可通过ERK1/2信号通路上调EGR-1的表达，在血管平滑肌细胞迁移和增殖中发挥重要作用；ERK1/2通路抑制剂PD98059、JNK通路抑制剂SP600125、P38通路抑制剂SB203580分别处理血管平滑肌细胞，均可显著抑制OPN诱导的EGR-1表达，而ERK1/2抑制剂PD98059的抑制作用最显著[22]。Yasuoka等[23]研究结果表明，胰岛素样生长因子结合蛋白-5（IGFBP-5）通过激活MAPK信号、诱导核EGR-1与IGFBP-5相互作用，促进纤维化基因转录，从而诱导肺纤维化表型。本研究发现，DCM患者心肌组织中MAPKs下游效应分子EGR-1的表达也明显升高，进一步表明MAPKs信号通路的磷酸化激活，促进下游应答分子EGR-1的表达，再对DCM心肌纤维化、心室重构发挥促进作用。

综上所述，MAPKs信号通路在促进DCM患者心肌纤维化中发挥重要作用，不是通过单一信号途径实现，而是多条信号通路协同促进DCM患者心肌纤维化的进展。动物实验中应用MAPKs信号通路各级激酶的抑制剂有助于抑制心肌纤维化，仍处于临床前研究阶段；目前，临床上尚缺乏治疗DCM的MAPKs信号通路抑制剂类药物。值得坚信的是，DCM的临床治疗，尤其在减轻心肌纤维化、改善心室重构方面，MAPKs通路仍是值得深入研究的重要靶点。