少阳生骨方含药血清对Raw264.7 细胞向破骨细胞分化的影响及机制研究

杨也，杨家福，钟霞，黄锐，罗兵，瞿刚波，郝攀登，曾智江，袁俊，袁毅*

(1.西南医科大学，四川 泸州；2.西南医科大学附属中医医院，四川 泸州）

0 引言

骨质疏松症（Osteoporosis，OP）是一种以骨组织微结构异常和骨量减少为特征，导致骨的脆性增加、骨微观结构退行性变化和易发生骨折的一种全身性代谢性骨病[1]。随着我国逐渐步入老龄化社会，骨质疏松症及其并发症将会给社会、医疗系统及家庭造成巨大的经济负担，骨质疏松症这一公共健康问题也将受到越来越多的关注[2]。破骨细胞占骨骼细胞的1%～2%，是一种由单核巨噬细胞前体分化而来的具有吞噬骨组织能力的多核巨噬细胞，也是主导骨吸收的关键细胞[3]。破骨细胞的数量和功能与骨重建的动态平衡密切相关，因此减少破骨细胞的数量，抑制破骨细胞的活性和功能，是当前预防和治疗骨质疏松症的研究重点和难点[4]。

《黄帝内经》中最早明确提出了“少阳主骨”的观点，《素问·热论》曰：“少阳主骨”。“少阳主骨”可能是世界上最早认识到骨质疏松是一种全身性的骨骼病症,具有非常重要的理论指导意义和临床价值[5]。我院王鸿度教授基于“少阳生骨”理论自拟出了少阳生骨方，以“和解少阳”为治疗原则，通过体表足少阳胆经调控骨强度的生理和病理变化，从而对以骨痛和易发骨折为主要临床表现的骨质疏松症有良好的治疗作用[6]。少阳生骨方在临床治疗骨质疏松症方面取得了良好的疗效，但对治疗骨质疏松症的具体作用机制仍缺乏相关研究。本次实验将以小鼠单核巨噬细胞白血病细胞（Mouse leukemia cells of monocyte macrophage，Raw264.7）为研究对象，通过核因子κB 受体活化因子配体（Receptor Activator of Nuclear Factor-KB Ligand，RANKL ） 将Raw264.7细胞诱导成破骨细胞，同时加入不同浓度的少阳生骨方含药血清进行干预，观察抗酒石酸酸性磷酸酶（Tartrateresistant acid phosphatase，TRAP）染色下不同组的破骨细胞形态和数目，并从基因蛋白水平上研究少阳生骨方对Raw264.7 向破骨细胞分化的影响和作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物及细胞

25 只SPF 级雄性SD 大鼠，购自西南医科大学实验动物中心。所有SD 大鼠均按实验室统一标准饲养。动物实验在西南医科大学实验动物中心完成，动物实验严格按照国际标准化操作流程执行。Raw264.7 细胞系（上海中国科学院典型培养物保存委员会细胞库）。

1.2 药物与试剂高糖

DMEM 培养基（HyClone 公司，美国）、优质胎牛血清（gibco公司，美国）、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色试剂盒（Solarbio公司，中国）、RANKL 诱导剂（Peprotech 公司，美国）、CCK-8 试剂盒（Dojindo 公司，中国）、RNA 抽提试剂盒（tiangen 公司，中国 ）、NF-κB p65 抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国）、Phospho-NF-κB p65 抗 体（Cell Signaling Technology 公 司，美国）、GAPDH 抗体（Cell Signaling Technology 公司，美国）、Goat Anti-Rabbit IgG（H+L） Secondary Antibody, HRP Conjugate 二抗（BOSTER 公司，美国）。

1.3 主要仪器和设备

F50 倒置生物显微镜摄像（Olympus，日本）、3K15 低温高速离心机（Sigma 公司，美国）、Bio-Tek 多功能酶标仪（Nikon 公司，日本）、荧光定量 PCR 仪(DNA Engine Opticon 2，Bio-rad，美国）等。

2 方法

2.1 含药血清的制备

将25 只SPF 级雄性SD 大鼠随机分为5 个组，每组5 只，设立1 个对照组（灌胃2mL 纯净水），4 个不同剂量的含药血清组（将少阳生骨方溶于2mL 纯净水中，含药浓度分别为0.07g/mL、0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL）；每天灌胃3 次，连续灌胃5d，在最后一次灌胃后，将大鼠麻醉满意并行腹主动脉取血，制作4 组含药血清、1 组无药血清保存备用。

2.2 细胞实验

将Raw264.7 细胞放入含完全培养基（含10% Gibco 胎牛血清+100 IU/mL 双抗+DMEM 高糖培养基）的培养皿中，并置于5%CO2、37℃的培养箱常规培养，每48h 换液1 次，当细胞生长达到约80%-90%融合度时，使用移液枪轻柔吹打皿底细胞、传代备用。

CCK-8 细胞增殖试验：将Raw264.7 细胞以每孔2×103个细胞接种于96 孔板，分为5 组，1 个对照组（不处理组：只加入完全培养基），和4 个不同浓度的少阳生骨方含药血清实验组（0.07g/mL、0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL），每组3 个复孔。在孵育箱培养24h、48h、72h 后，弃去培养基，每孔加入10ul 的CCK-8 试剂和90ul 的完全培养基，并设立空白孔，只含有培养基和CCK-8 溶液，用酶标仪测波长在450nm 吸光度值并记录结果,重复试验3 次。

2.3 TRAP 染色试验

将生长良好的Raw264.7 细胞以每孔1×104个细胞接种于24 孔板中，加入完全培养基，置于37℃、5%CO2孵育箱中培养，在细胞贴壁12h 后，去掉原培养基，加入含RANKL 的完全培养基诱导细胞分化，并根据不同的需求分组干预：1 组对照组：50ng/mLRANKL 完全培养基+10%0g/mL 含药血清；4 组实验组：50ng/mLRANKL 完全培养基+10%含药血清（浓度0.07g/mL、0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL）。每组均设3 个平行孔。待各组细胞诱导至第5 d 时进行TRAP 染色，具体方法参照试剂盒说明书进行操作。观察TRAP 染色阳性破骨细胞的形态（胞体较大，细胞质内酶活性部位呈紫红色，细胞核数目≧3）。并在100 倍视野下随机选取10 个视野，分别对5 组细胞中TRAP 染色阳性的破骨细胞进行计数，取平均值，上述实验重复3 次。

2.4 实时定量PCR 检测

将生长趋势良好的Raw264.7 细胞以每孔1×105个细胞接种于6 孔板中，细胞贴壁后更换培养液，将细胞分为6 组,每组3 个复孔。培养3d 后，按照试剂盒说明书提取各组细胞的总RNA，将RNA 反转录为cDNA，用RT-PCR 扩增仪对cDNA 产物进行RTPCR 反应。以GAPDH 为内参，检测基因引物序列见表1，使用2-△△CT法分析Ctsk、C-fos、NFATc1 的mRNA 的表达，重复上述实验步骤3 次。

表1 CTsK、NFATcl、c-Fos 和GADPH 的引物序列

2.5 Western bolt 测定蛋白表达

将Raw264.7 细胞常规培养传代后，以每孔1×105个细胞接种于6 孔板中，待细胞贴壁后更换培养液，将细胞分为6 组（1 组空白组、1 组对照组、4 组实验组）。培养3d 后，按照试剂盒说明书分别提取6 个组细胞的蛋白，并通过BCA 法进行蛋白定量，高温100℃煮沸5min，使蛋白充分变性，经SDS-PAGE 电泳分离，然后转膜，5%脱脂牛奶封闭1h，加入一抗(1：1 000 稀释)，4℃摇床过夜，印迹膜用TBST 缓冲液漂洗3 次后，加入二抗(1：1 000 稀释)，置于摇床上室温孵育1h。在凝胶成像系统中曝光并拍照；采用Image j 图像分析软件，对光密度积分值进行分析。

2.6 统计分析

3 结果

3.1 少阳生骨方含药血清对Raw264.7 细胞增殖的影响

CCK8 检测结果如图1 所示：培养第24h 时，与对照组相比，少阳生骨方含药血清对各实验组Raw264.7 细胞增殖的影响，差异无统计学意义（P=0.155）；培养第48h 时，与对照组相比，少阳生骨方含药血清对各实验组Raw264.7 细胞增殖的影响，差异无统计学意义（P=0.173）；培养第72h 时，与对照组相比，少阳生骨方含药血清对各实验组Raw264.7 细胞增殖的影响，差异无统计学意义（P=0.070）。

图1 不同浓度少阳生骨方含药血清对Raw264.7 细胞增殖的影响

3.2 不同浓度少阳生骨方对Raw264.7 细胞向破骨细胞分化的影响

根据图2 所示，5 组Raw264.7 细胞在加入50ng/mLRANKL 和不同浓度的少阳生骨方含药血清干预5d 后，分化形成了TRAP 染色阳性的破骨细胞：破骨细胞的形态不一，有伪足和突起，细胞体积大，细胞质内酶活性部位呈紫红色，且细胞核数目≧3。从图3可知，与对照组（0g/mL 含药血清+50ng/mLRANKL）相比，随着少阳生骨方含药浓度的增加，各实验组破骨细胞的数目逐渐下降，在含药浓度为0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL 时，差异具有统计学意义（P＜0.01）。0.56g/mL 浓度的少阳生骨方对Raw264.7 细胞向破骨细胞分化的抑制作用最强。

图2 不同浓度含药血清组TRAP 染色阳性细胞在细胞光镜下（×100）

图3 对照组及实验组TRAP 染色阳性细胞数量

3.3 RT-PCR 检测结果

根据图4 所示，RT-PCR 检测结果表明，加入50ng/mL RANKL 诱导剂后，对照组的破骨细胞标志性基因Ctsk、C-fos和NFATc1 分 别 为4.360±0.499 、3.192±0.130 、6.271±0.490，与空白组相比明显升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。当少阳生骨方含药血清浓度为0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL 时，Ctsk mRNA 的表达分别为3.403±0.118、2.472±0.309、1.589±0.319，与对照组相比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。当少阳生骨方含药血清浓度为0.07g/mL、0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL时，NFATc1 mRNA 的表达分别为2.743±0.229、2.147±0.086、1.644±0.060、1.175±0.040，与对照组相比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。当少阳生骨方含药血清浓度为0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL 时，C-fos mRNA 的表达分别为3.950±0.541、2.999±0.483、1.928±0.258，与对照组相比明显降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。

（空白组：0g/mL 含药血清+0ng/mLRANKL；对照组：0g/mL 含药血清+50ng/mLRANKL；实验组1：0.07g/mL 含药血清+50ng/mLRANKL；实验组2：0.14g/mL 含药血清+50ng/mLRANKL；实验组3：0.28g/mL 含药血清+50ng/mLRANKL；实验组4：0.56g/mL 含药血清+50ng/mLRANKL。C-fos:伤害性信息与即刻早期基因；Ctsk：组织蛋白酶K；NFATc1：核转录因子激活的T 细胞1。与空白组比较：***P＜0.001；与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。）

3.4 Western blot 法检测结果

根据图5 所示，在使用不同浓度的少阳生骨方含药血清干预Raw264.7 细胞向破骨细胞分化的3d 后，与空白组相比，加入50ng/mL RANKL 的对照组出现了NF-κB P65 蛋白磷酸化的高表达，差异有统计学差异（***P＜0.001）；与对照组相比，在实验组含药血清浓度为0.14g/mL、0.28g/mL、0.56g/mL 时，随着浓度的增加，NF-κB P65 蛋白磷酸化水平逐渐下降，差异有统计学意义（***P＜0.001）。

空白组：0g/mL 含药血清+0ng/mLRANKL；对照组：0g/mL 含药血清+50ng/mLRANKL；实验组1：0.07g/mL 含药血清+50ng/mLRANKL；实验组2：0.14g/mL 含药血清+50ng/mLRANKL；实验组3：0.28g/mL 含药血清+50ng/mLRANKL；实验组4：0.56g/mL 含药血清+50ng/mLRANKL。与空白组比较：***P＜0.001；与对照组比较：*P＜0.05，**P＜0.01，***P＜0.001。

4 讨论

骨质疏松症是一种骨量减少、骨组织微结构破坏，从而导致骨脆性增加、易发生骨折的全身代谢性骨病。骨质疏松是人体骨重建动态平衡失衡的结果，即破骨细胞主导的骨吸收超过成骨细胞主导的骨形成所致[7]。因此当前对骨质疏松症的治疗原则为抑制破骨细胞主导的骨吸收，以及促进成骨细胞主导的骨形成。目前通过抑制破骨细胞主导的骨吸收从而改善骨质疏松症的药物主要有双磷酸盐类、雌激素及其受体调节剂、降钙素等[8]，但这些药物具有价格昂贵、不良风险高等副作用，需要严格掌握其适应症及使用时间。而我国传统的中医药具有价格低廉、效果较好且副作用小等独特的优势，在临床对骨质疏松症的治疗中发挥着越来越重要的作用[9]。

我院王鸿度教授基于《黄帝内经》中“少阳主骨”理论，在柴胡桂枝汤上加减自拟出了少阳生骨方，具体组成为：柴胡、桂枝、法半夏、党参、甘草、黄芩、大枣、骨碎补、川牛膝、山茱萸等[10]。少阳生骨方以“少阳主骨”为理论依据，全方旨在寒热平调、和解少阳、补肾健骨，通过多靶点的治疗来改善骨质疏松症的临床症状，同时具有价格低廉、毒副作用低等优势。课题组在前期研究中探索发现了少阳生骨方能促进骨髓间充质干细胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）增殖并向成骨细胞分化，从而改善骨质疏松症相关症状，同时发现少阳生骨方促进BMSCs 成骨分化的机制可能与上调BMP-2 和Runx2 mRNA 和蛋白的表达有关[11]。但对于破骨细胞的作用及机制研究尚不明确，因此本次实验旨在通过RANKL 诱导Raw264.7 细胞分化为成熟破骨细胞，探索不同浓度的少阳生骨方含药血清对破骨细胞增殖分化的影响和作用机制。

Raw264.7 细胞是小鼠源性的单核巨噬细胞，也是破骨前体细胞的一种，通过RANKL 诱导Raw264.7 细胞分化成破骨细胞是目前体外研究破骨细胞最常用的培养方法[12]。本次实验通过CCK8法发现不同浓度的少阳生骨方含药血清对Raw264.7 细胞增殖的影响无明显差异，表明少阳生骨方对Raw264.7 细胞无明显细胞毒性，可以将0.07、0.14、0.28、0.56g/mL 的药物浓度选为本实验少阳生骨方含药血清的药物干预浓度。当RANKL 诱导剂与破骨前体细胞表面的受体RANK 结合，进一步激活NF-KB、NFAT 等下游信号通路。这些通路被激活后，破骨细胞分化的相关特异性基因如C-fos、NFATc1、Ctsk 等出现表达上调，使破骨前体细胞分化为成熟的破骨细胞[13,14]。本次实验在RANKL 诱导Raw264.7 细胞向破骨细胞分化的第5 天，通过TRAP 染色观察不同组破骨细胞的形态和数目，发现随着少阳生骨方药物浓度的增加，TRAP 染色阳性破骨细胞数目呈药物依赖性降低。说明少阳生骨方能抑制破骨细胞的增殖，减少破骨细胞的生成。Ctsk 即组织蛋白酶K，是破骨细胞作用中最主要的酶，Ctsk 可以通过调控破骨细胞的凋亡控制破骨细胞数量，在骨吸收中发挥关键作用[15]。C-fos 基因与NFATc1 是破骨细胞中重要的转录调节因子，C-fos 基因通过激活下游因子NFATc1 促进破骨细胞分化成熟，二者都是破骨细胞的增殖分化过程中至关重要的一部分[16,17]。本次实验中，RT-PCR发现，与空白组相比，加入RANKL 的对照组Ctsk、C-fos、NFATc1的mRNA 呈现高表达。而与对照组相比，不同浓度的少阳生骨方含药血清组Ctsk、C-fos、NFATc1mRNA 的表达，随着浓度的增加呈浓度依赖性下降。说明少阳生骨方能抑制破骨细胞相关特异性基因Ctsk、C-fos、NFATc1 mRNA 的表达。

图4 RT-PCR 比较不同组破骨细胞分化标志性基因表达情况

图5 Western blot 比较各组细胞NF-κBp65 蛋白磷酸化的水平

NF-κB 是一种存在于细胞当中的至关重要的转录因子，不仅参与慢性炎症的调节过程，同时也对维持机体的正常生理功能起着重要的作用。当RANKL 刺激NF-κB 活化后，IkB 激酶（IKK）复合物被激活，其中IKKβ 将IkB 磷酸化，使得IkB 被泛素化降解。IkB 被降解后，释放的NF-κB p65 转移到细胞核，与DNA 上的相关位点相结合，进一步促进破骨细胞特异性基因的表达，最终导致破骨细胞的形成和分化[18,19]。相关研究证实，通过抑制NF-κB的表达，可以抑制破骨细胞的增殖分化，进而改善骨质疏松症状[20]。本次实验通过Western blot 法检测不同浓度少阳生骨方对破骨细胞NF-KBP65 蛋白磷酸化水平表达的影响，发现少阳生骨方含药血清能抑制破骨细胞 NF-κB p65 蛋白磷酸化。说明少阳生骨方抑制Raw264.7 细胞向破骨细胞分化的能力与抑制NFκB p65 蛋白磷酸化有关。

综上所述，少阳生骨方能抑制Raw264.7 细胞向破骨细胞分化，当少阳生骨方含药血清浓度为0.56g/mL 时，抑制作用最强。并且少阳生骨方抑制Raw264.7 细胞向破骨细胞的分化与对NFκB p65 蛋白磷酸化的抑制相关。本次实验从基因蛋白层面证实了少阳生骨方能抑制破骨细胞主导的骨吸收，改善骨质疏松症状，为少阳生骨方治疗骨质疏松症提供了相关的实验资料。