活血化湿汤治疗肝癌的网络药理学机制

楼汪洲洋，许杰，戚璐，徐俊，程良斌

（湖北中医药大学，湖北 武汉）

0 引言

活血化湿汤是河南省中医院刘高仁、肖亚珍医师自拟方药，经临床实际试用，活血化湿汤治疗晚期肝癌黄疸收到良好效果，但其对肝癌本身是否也具有抗癌效果以及潜在作用机制并无相关数据，故笔者通过网络药理学工具对活血化湿汤治疗肝癌的潜在机制进行分析探讨，寻找活血化湿汤可能的治疗肝癌的途径。

中药组方是多组分、多靶点及其组分间协同作用的复杂体系,因其主要成分复杂, 作用途径较多, 使得中药的深入研究极为困难, 而网络药理学融合了系统生物学和多向药理学的思想, 被应用到生命科学的多个领域, 如新药靶的识别、先导化合物的发现、作用机制的研究、物质基础的筛选等, 为复杂中药系统的研究提供了新的思路和视角[1]。网络药理学基于“药物-靶点-疾病”相互作用网络, 其研究策略的整体性、系统性特点与中医学从整体观念、辨证论治的角度去诊治疾病的理论，中药及其方剂的多成分、多途径、多靶点协同作用的原理不谋而合[2]。本研究采用网络药理学研究方法, 对活血化湿汤主要功效物质以及配伍机制进行研究，为活血化湿汤治疗肝癌作用机制的科学内涵提供参考。

1 材料与方法

1.1 活血化湿汤的化学成分

本文通过查询BATMAN（http://bionet.ncpsb.org/batmantcm/），以Score＞20 分，P＜0.05 作为搜索条件，检索活血化湿汤全方组成药物党参、茵陈、赤芍、栀子、大黄、益母草、泽兰、红花、茯苓、白术、赤小豆、白茅根、玉米须的所有化学成分和相应靶蛋白，去除重复化合物和蛋白，共收集203 种化合物和2012 个靶蛋白。

1.2 化合物-靶点网络的构建

将收集的化合物与其靶点蛋白上传至Cytoscape 3.7.1 软件，生成一个体现药物靶点相互作用的网络图, 以探究活血化湿汤的药理学作用机制。

1.3 疾病靶点的确定

通过DisGeNET，OMIM，genecards，HPO 检索并删除重复项，筛出1111 个肝癌相关的靶点。

1.4 蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络的构建和GO、KEGG 等途径富集分析

将活血化湿汤与肝癌靶点蛋白进行映射筛选，得到302 个活血化湿汤-肝癌相关靶点蛋白，导入STRING（https://string-db.org/）进行多种蛋白质关联分析，获取蛋白的相互作用以及蛋白作用途径的分类富集分析。

2 结果

2.1 活性化合物的筛选

通 过 查 询BATMAN（http://bionet.ncpsb.org/batman-tcm/），设置搜索筛选条件Score＞20 分，P＜0.05，分次输入活血化湿汤全方组成药物党参、茵陈、赤芍、栀子、大黄、益母草、泽兰、红花、茯苓、白术、赤小豆、白茅根、玉米须进行查询，获取各个中药符合Score＞20 的化学成分和相应靶蛋白，分别为党参化学成分71 个，蛋白1260 个；茵陈化学成分19 个，蛋白910 个；赤芍化学成分9个，蛋白56 个；栀子化学成分14 个，蛋白665 个；大黄化学成分30 个，蛋白936 个；益母草化学成分9 个，蛋白690 个；泽兰化学成分4 个，蛋白216 个；红花化学成分22 个，蛋白525 个；茯苓化学成分18 个，蛋白525 个；白术化学成分5 个，蛋白56 个；赤小豆化学成分3 个，蛋白416 个；白茅根化学成分7 个，化学成分53个；玉米须化学成分4 个，蛋白258 个，化学成分合计215 个，运用EXCEL 合并筛选去除重复成分和蛋白，共收集203 种化学成分和2012 个靶蛋白（其中有12 个化学成分重复）。

2.2 活血化湿汤化合物-靶点网络图的构建

将收集整理的化合物与其靶点蛋白导入至Cytoscape 3.7.1 软件，生成一个体现药物-靶点相互作用的网络图（图1）, 以探究活血化湿汤本身的药理学作用机制。

图1 活血化湿汤药物成分与靶蛋白对应关系（左侧药物成分，右侧靶蛋白，由内向外按Drgaee 大小分布，越接近圈中心，该药物/蛋白所对应的蛋白/药物数越多）

2.2.1 活血化湿汤药物成分见图2，详细成分见表2-1。

其中对应蛋白数大于100 的化学成分，见图3。

图2 活血化湿汤药物成分

图3 活血化湿汤中对应蛋白数大于100 的化学成分

表3 -1 活血化湿汤中对应蛋白数大于100 的化学成分

表2 -1 活血化湿汤药物成分表

续表2-1 活血化湿汤药物成分表

2.2.2 活血化湿汤靶蛋白见图4，主要靶蛋白见图5，表5-1

图4 活血化湿汤靶蛋白

图5 主要靶蛋白（蛋白对应化学成分数大于等于20）

2.3 肝癌疾病靶点蛋白的获得

将 Adult Hepatocellular Carcinoma、Childhood Hepatocellular Carcinoma、Early Hepatocellular Carcinoma、Fibrolamellar Hepatocellular Carcinoma、Hepatitis B Virus-Related Hepatocellular Carcinoma、Hepatocellular Carcinoma、Hepatoblastoma、Hepatocellular adenoma、Neoplasm of the liver 分别输入DisGeNET，OMIM，genecards，HPO 数据库进行检索，其中DisGeNET 以得分大于0.01 为标准获取蛋白153 个，Genecards以得分大于10 为标准获取蛋白918 个，HPO 获取蛋白86 个，OMIM 获取蛋白105 个，将获取的以上蛋白汇总并删除重复项，筛出1111 个肝癌相关的靶点蛋白。

2.4 蛋白质-蛋白质相互作用 (PPI) 网络的构建和GO、KEGG 等途径富集分析

将上述获取的肝癌靶蛋白与活血化湿汤靶蛋白进行映射，获得活血化湿汤-肝癌关联靶蛋白302 个，具体蛋白如表6-1：

2.4.1 将表6-1 中302 个活血化湿汤-肝癌关联靶蛋白上传STRING 网站，设定为置信度＞0.9,隐藏断开的节点，进行蛋白质-蛋白质关系分析和GO、KEGG 等途径富集分析，获得276 个蛋白质的蛋白质-蛋白质相互关系网络及富集分析结果，蛋白质相互关系网络见图6。

表5 -1 主要靶蛋白（蛋白对应化学成分数大于等于20）

表6 -1 活血化湿汤-肝癌关联靶蛋白

将蛋白质-蛋白质关系下载并导入Cytoscape 3.7.1 软件，构建PPI 蛋白质关系分析网络，运用Cytoscape 的NetworkAnalyzer功能进行分析，以Dagree（度中心性）大小为蛋白质重要性评判标准，Dagree 越大，证明该蛋白质与其他蛋白质关联越紧密，参与治疗肝癌的重要性就越大。

图6 活血化湿汤-肝癌关联靶蛋白STRING 蛋白质-蛋白质相互关系网络分析

图7 276 个蛋白质的蛋白质-蛋白质相互关系网络图

结合图7 和查阅上表7-1，我们可以得知，关联度最重要的TOP10 蛋 白 依 次 是STAT3、TP53、PIK3CA、MAPK1、PIK3R1、AKT1、EP300、MAPK3、JUN、CREBBP，意味着以上蛋白可能涉及活血化湿汤用于治疗肝癌。

2.4.2 活血化湿汤-肝癌关联蛋白的GO、KEGG 等途径富集分析

STRING 网站有GO、KEGG 等途径富集分析功能，对276 个蛋白的富集分析见表8。

3 总结

3.1 通过以上图表结合实际综合分析，活血化湿汤能用于治疗肝癌的主要KEGG 途径可能是癌症通路、PI3K-Akt 信号通路、癌症糖蛋白、人类乳头瘤病毒感染、MAPK 信号通路、乙型肝炎通路、癌症小分子RNA、HTLV-I 感染途径、肝细胞癌通路、FoxO 信号通路、Ras 信号通路、HIF-1 信号通路等途径。

3.2 其涉及的生物过程主要与细胞过程、生物调节、刺激反应、代谢过程、有机物质代谢过程、生物过程调节、细胞代谢过程、细胞过程调节、初级代谢过程、化学反应、细胞对刺激的反应、氮化合物代谢过程、多细胞组织过程、生物过程的正规律、代谢过程调节、细胞过程的正调节、发展过程、细胞代谢过程调节、原发性代谢过程调节等过程密切相关。

表7 -1 276 个蛋白质的蛋白质-蛋白质关系大小

续表7-1 276 个蛋白质的蛋白质-蛋白质关系大小

表8 关联蛋白KEGG 途径（TOP50）

表9 关联蛋白生物过程（TOP50）

表10 关联蛋白分子功能(TOP50)

表11 核心蛋白结构域分析

3.3 对分子功能的影响主要在蛋白质结合、离子结合、有机循环复合结合、催化活性、杂环复合结合、酶结合、阳离子结合、金属离子结合、信号受体结合相同蛋白结合、阴离子结合、小分子结合、药物结合、分子调节、核苷酸结合、蛋白质二聚作用、碳水化合物衍生物、转移酶活性、核酸结合、作用于DNA 结合蛋白质、核糖核苷酸结合催化活性，转录调节器活动、嘌呤核苷酸结合、嘌呤核糖核酸、嘌呤核糖核酸、腺酰核苷酸结合、腺基核糖核苷酸结合、ATP 结合、含蛋白质的复杂装订、蛋白质均聚化活动、转录因子结合、分子换能器活动、过渡金属离子结合等方面。

3.4 作用的主要核心蛋白域家族：蛋白激酶域、核激素受体类域超家族、酪氨酸蛋白激酶催化域、Serine / threon 蛋白激酶、细胞色素P450 超家族、AAA + atp 酶域、agc -激酶、BLC2 家族、TGF-β 蛋白、ABC 跨膜转运蛋白超家族等。

4 讨论

活血化湿汤全方充分体现了大积大聚，必须大破方能大立，其对伤肝久积成疾之巨块型肝癌以攻为主，寓补于攻的思想。积无除，病不解，不搜而逐之，日进补汤无益也。也应注意攻邪而不伤正，养正而不助邪[3]。

通过网络药理学方法分析，活血化湿汤其治疗肝癌的潜在通路除了癌症通路外，首当其冲的就是PI3K-Akt 信号通路。目前医学界通过对肝癌患者癌组织以及肝癌细胞株内存在多条信号通路过度活化的研究中，我们可以发现PI3 K/Akt 信号通路是细胞内外信号转导一个重要纽带，在细胞抗凋亡、增殖、分化以及侵袭转移中起到至关重要作用[4]。另外MAPK 信号通路抑制肝癌细胞增殖、侵袭和迁移[5]， PI3K/AKT/FOXO4 信号轴影响HCC 的增殖能力与凋亡能力,在HCC 的发病和进展中起着非常重要的作用，[6]影响Ras 信号通路激活Myc 表达调节细胞核内周期进程[7]。对HIF-1 信号通路可通过抑制HIF-1α 影响癌细胞的能量代谢,进而达到抑制肿瘤细胞增殖和促进肿瘤细胞凋亡的目的[8-10]。

本研究通过网络药理学技术层面，基于中药药理学BATMAN数据库平台的活血化湿汤有效成分及体内预测靶标理论化揭示了活血化湿汤对肝癌的作用机制，为活血化湿汤及相关药物的新药研发和机制研究奠定基础。