香榧叶精油的化学成分、抗氧化及抑菌活性的研究

曾 琳 林秋美 韩成云 邹一平

(宜春学院化学与生物工程学院1，宜春 336000)(江西省天然药物活性成分研究重点实验室；宜春学院化学与生物工程学院2，宜春 336000)

香榧(Torreya grandis)，俗称妃子树，红豆杉科榧属种常绿乔木，为中国原产树种，适宜生长在中国南方湿润多雨地区，目前主要分布于浙江、福建、江苏、江西、安徽和湖南等地[1]。香榧的各组织器官都富含挥发性成分，其中的活性物质主要是萜烯类、酮类、醇类、木质素、多酚类等化合物，具有多种生物活性，如体外抑菌、抗氧化、杀虫和趋避等活性[2]。林祖铭等[3]利用气相色谱-质谱联用法(GC-MS)从香榧假种皮挥发油的化学成分中鉴定出32 种化学成分，其中α-蒎烯、α-水芹烯、柠檬烯的含量最高，占总量的73.5%。张露等[4]研究分析了香榧叶、茎、假种皮、种壳和种仁的体外清除自由基的能力，发现其对DPPH自由基、ABTS+自由基、α-葡萄糖苷酶等均具有较强的活性抑制能力。在体外抑菌实验中，李彪等[5]研究发现香榧假种皮精油对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有较强的抑菌作用，且新鲜比干燥的抑菌效果更显著。目前对香榧属植物的研究主要集中于香榧假种皮和果实等的化学成分提取方法及其生物活性[6]，本研究主要比较其挥发性成分的抗氧化性以及抑菌活性。

本实验采用水蒸气蒸馏法提取香榧叶精油，在蒸馏过程中，香榧叶内部的挥发性成分通过水蒸气的渗透、扩散作用，扩散到组织表面，表面油分不断气化，随水蒸气一同蒸出[7-8]，虽提取率相对较低，但提取的精油不会有化学溶剂残留，用此精油研制的产品相对安全，且对抗氧化活性和抑菌活性测定的影响较小。采用GC-MS方法，对香榧叶精油的化学成分进行分析，并测定其ABTS+自由基、DPPH自由基和羟自由基的清除能力，探究其抑菌活性和最低抑菌浓度的测定，为植物源新型抗氧化剂、抑菌剂和保鲜剂的研究提供一定的参考，为香榧植物的挥发性产品的开发利用提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂、菌种

新鲜香榧，2017年12月采于宜春市袁州区竹亭乡药材生产基地。邻二氮菲；1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)；2,2’-联氮双(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)二铵盐(ABTS)；黑曲霉菌；蜡样芽胞杆菌;枯草芽孢杆菌;铜绿假单胞菌；金黄色葡萄球菌；大肠杆菌。

1.2 主要仪器

TX05-02多功能精油提取器；7890A(G3440A) GC-MS气质联用仪。

1.3 方法

1.3.1 香榧叶精油的提取方法

称取新鲜香榧叶500 g，剪碎装入小布袋后放入精油提取器的提取筒中，按料液比1∶10加入纯水。安装好仪器，加热升温，调节功率至2 000 W，观察温度计上升到60 ℃时，将功率调到800 W。温度继续上升至100 ℃，精油随着水蒸气一并蒸发，冷却于分液管中。回流4 h后，停止加热。蒸馏结束，打开活塞，分离放出上层精油，密封，4 ℃下保存，备用。

1.3.2 气相色谱-质谱分析方法(GC-MS)

气相色谱条件：Rtx-5MS石英毛细管柱(30 m×0.25 mm，0.25 μm)。升温程序：初始温度50 ℃，保持2 min，以5 ℃/min升至150 ℃，保持1 min，再以8 ℃/min升至280 ℃，保持2 min。进样口温度250 ℃，载气为N2，流速为1 mL/min，分流比15∶1。

质谱条件：接口温度280 ℃，电子轰击(EI)源，电子能量70 eV，扫描质量范围33.00～550.00 amu，电子倍增器电压1 000 V，溶剂延迟时间3 min。

样品调制和分析：取香榧叶精油，加入二氯甲烷配成1 mg/mL的溶液，加少量无水硫酸钠脱水，进样量为1 μL，用气相色谱-质谱联用仪分析。

1.3.3 抗氧化活性的测定1.3.3.1 ABTS+自由基清除能力的测定[9]

ABTS工作液的配制：取5 mL的ABTS溶液(7 mmol/L)与88 μL过硫酸钾溶液(140 mmol/L)混合，在室温下避光静置过夜，得到ABTS+储备液，使用前用无水乙醇稀释，使其在734 nm波长下的吸光度为0.70±0.02，即得ABTS+工作液。

样品反应体系配制：取10支试管，按照表1依次加入1.0 mL的ABTS+工作液和1 mg/mL不同体积香榧叶精油乙醇溶液(10 mg精油用无水乙醇定容于10 mL容量瓶中)，再加无水乙醇，使最终体积为4.0 mL，放置10 min，在734 nm波长处测其吸光度，记为A。

标准反应体系溶液配制：量取1.0 mL ABTS工作液和3.0 mL无水乙醇溶液于试管中，放置30 min，在734 nm波长处测其吸光度，记为A0。

对照样品维生素C的配制：将香榧叶精油样品溶液替换为相同质量浓度的维生素C溶液，其他与样品反应体系的配制方法，记为Ai。

所有操作重复测定3次，取平均值，按式(1)计算ABTS+自由基清除率：

(1)

表1 ABTS+自由基清除能力测定试剂配制表

1.3.3.2 DPPH自由基清除能力的测定[10]

样品反应体系配制：取10支试管，按照表2依次加入1.0 mL的2×10-4mol/L DPPH溶液(无水乙醇作溶剂)和1 mg/mL不同体积香榧叶精油乙醇溶液(制备方法同1.3.3.1)，再加无水乙醇，使最终体积为4.0 mL，放置30 min，在517 nm波长处测其吸光度，记为A。

标准反应体系溶液配制：量取1.0 mL DPPH溶液和3.0 mL无水乙醇溶液于试管中，放置30 min，在517 nm波长处测其吸光度，记为A0。

对照样品维生素C的配制：将香榧叶精油样品溶液替换为相同质量浓度的维生素C溶液，其他与样品反应体系的配制方法类似，记为Ai。

所有操作重复测定3次，取平均值，按式(2)计算DPPH自由基清除率：

(2)

表2 DPPH自由基清除能力测定试剂配制表

1.3.3.3 羟自由基清除能力的测定[11]

过氧化氢反应体系配制：取10支试管，依次加入0.5 mL的0.75 mmol/L邻二氮菲无水乙醇溶液、1.0 mL的0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0～7.2)、0.5 mL纯水、0.5 mL的0.75 mmol/L硫酸亚铁溶液，充分混匀。再加入0.5 mL的0.03%过氧化氢，于37 ℃水浴60 min，以体积比为1∶2的磷酸缓冲液与纯水作参比液，在536 nm波长处测其吸光度，记为吸光度A1。

空白反应体系配制：与过氧化氢反应体系配制方法类似，只是将过氧化氢替换为纯水，其他不变，记为空白管的吸光度A0。

样品管反应体系配制：与过氧化氢反应体系配制方法类似，只是将过氧化氢替换为1 mg/mL不同体积香榧叶精油乙醇溶液(制备方法同1.3.3.1)，如表3所示，其他不变，记为样品管的吸光度A2。

对照样品维生素C的配制：与样品管反应体系配制方法类似，只是将香榧叶精油样品溶液替换为相同质量浓度的维生素C溶液，其他不变，记为Ai。

所有操作重复测定3次，取平均值，按式(3)计算羟自由基清除率：

(3)

表3 羟自由基清除能力测定试剂配制表

1.3.4 香榧叶精油抑菌活性研究1.3.4.1 培养基的制备[12]

LB液体培养基：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，氯化钠10 g，pH值7.0，加纯水至1 000 mL，120 ℃灭菌30 min备用。LB固体培养基则另加琼脂15 g，其他条件相同。

马铃薯液体培养基：马铃薯去皮，切块取200 g，加纯水1 000 mL煮沸30 min，过滤取上清液，加入蔗糖20 g，搅拌混匀后补加纯水至1 000 mL，pH值7.0，120 ℃灭菌30 min备用。马铃薯固体培养基则另加琼脂20 g，其他条件相同。

1.3.4.2 菌悬液的制备[12]

用接种环挑取同一菌落的黑曲霉菌，在马铃薯固体培养基中进行活化培养后，接种于2 mL的马铃薯液体培养基中，在25～28 ℃摇床中培养48 h后待用。用接种环挑取同一菌落的蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌，在LB固体培养基中分别进行活化培养后，接种于2 mL的LB液体培养基中，在37 ℃摇床中培养24 h后待用。霉菌和细菌分别用马铃薯液体培养基和LB液体培养基稀释至浓度为106～107CFU/mL的菌悬液，分别采用显微镜计数法和平板计数法测量菌体个数。

1.3.4.3 抑菌圈的测定[13]

取各供试菌悬液各200 μL于固体培养基上均匀涂布，稍微晾干后，均匀放置3个牛津杯，编号为1、2、3，往1号和2号牛津杯内分别加入100 μL的质量浓度分别为0.5、1.0 mg/mL的香榧叶精油乙醇溶液，往3号牛津杯杯内加入100 μL相同浓度的无水乙醇作为空白对照，置37 ℃恒温培养24 h后观察，采用十字交叉法测各抑菌圈直径。每个菌种设3个重复，抑菌圈直径取平均值。

1.3.4.4 最低抑菌浓度的测定[14]

配制不同质量浓度梯度(0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL)的香榧叶精油乙醇溶液，取1.0 mL，均匀涂布于含各供试菌的平板上，以相同浓度的无水乙醇作空白对照，置于恒温培养箱中37 ℃培养24 h，取出观察各供试菌的生长情况。每个菌种设3个重复，最低抑菌浓度取平均值。

1.3.5 数据处理

实验数据采用SPSS 19.0软件进行分析，用Excel 2016软件进行作图，计量采用t检验，以P<0.05作为数据间的显著性差异，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 香榧叶精油GC-MS分析结果

经GC-MS分析得香榧叶精油总离子流图谱，如图1所示。经GC-MS联用仪所配置的NIST-MS谱库进行检索，并与文献[15]进行核对，分析各组分的质谱数据，通过保留指数对化合物进行定性，采用峰面积归一化法[16]对化合物进行定量，确认了40种成分，占总量的99.74%，如表4所示。在香榧叶精油中，主要成分为烯萜类、酮类、醇类、醛类和酯类等，其中，相对质量分数较大的组分有7种，分别是柠檬烯(24.75%)、α-蒎烯(15.26%)、β-蒎烯(9.19%)、香榧酯(7.95%)、β-谷甾醇(5.42%)、月桂烯(4.02%)、δ-杜松烯(3.47%)。单萜、倍半萜及其含氧衍生物有30种，相对质量分数总和为86.38%；酮类有3种，相对质量分数总和为2.65%；醇类有2种，相对质量分数总和为0.4%；醛类有1种，相对质量分数总和为1.24%；酯类有4种，相对质量分数总和为9.07%。

图1 香榧叶精油总离子流图

表4 香榧叶精油化学成分及含量

2.2 抗氧化性测定结果分析

2.2.1 ABTS+自由基清除能力的测定结果

ABTS在氧化剂的作用下会形成亚稳态的ABTS+，若加入的样品具有抗氧化活性，则会与ABTS+发生反应，使溶液的吸光度降低[17]，通过与对照组对比，得到样品对ABTS+自由基的清除效果。如图2所示，随着香榧叶精油浓度的增加，清除ABTS+自由基的能力逐渐增强，其清除率在60%～85%之间，且在相同浓度下，香榧叶精油的清除能力要强于VC。

图2 香榧叶精油清除ABTS+自由基能力

2.2.2 DPPH自由基清除能力的测定结果

DPPH自由基在波长517 nm处有最大吸光度，其吸光值降低越多，说明清除DPPH自由基的能力越强[18]。如图3所示，随着香榧叶精油浓度的增加，清除DPPH自由基的能力逐渐增强，其清除率在50%～70%之间，且在相同浓度下，香榧叶精油的清除能力要强于VC。

图3 香榧叶精油清除DPPH自由基能力

2.2.3 羟自由基清除能力的测定结果

人体内的羟自由基是活性氧自由基，可以氧化各种生物大分子，与器官衰老、肿瘤发生、辐射损伤和细胞吞噬等疾病相关[19]。如图4所示，随着香榧叶精油浓度的增加，清除羟自由基的能力逐渐增强，其清除率在60%～80%之间，且在相同浓度下，香榧叶精油的清除能力要强于VC。

图4 香榧叶精油清除羟自由基能力

2.3 香榧叶精油抑菌活性的测定结果分析

2.3.1 香榧叶精油的抑菌效果

如图5所示，6种供试菌的抑菌圈直径均在15 mm以上，属最敏感型菌[20]，说明香榧叶精油对这6种菌都有较强的抑制作用，与对照组差异显著，具有统计学意义(P<0.05)，其抑菌效果表现为真菌强于细菌。比较抑菌圈大小，香榧叶精油的抑菌效果为：黑曲霉菌(ANI)>蜡样芽孢杆菌(BCE)>枯草芽孢杆菌(BSU)>铜绿假单胞菌(PAE)>大肠杆菌(ECO)>金黄色葡萄球菌(SAU)。

图5 香榧叶精油对供试菌的抑菌圈直径

2.3.2 香榧叶精油的最低抑菌浓度

由表5可知，随着香榧叶精油质量浓度的增大，6种供试菌的生长均先后出现抑制，其中黑曲霉菌最先出现抑制现象，蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌随后出现抑制现象，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌最后出现抑制现象，其最低抑菌质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.6、0.8、0.8 mg/mL。

表5 香榧叶精油的最低抑菌质量浓度

注：“++”表示供试菌生长良好，未受到抑制；“+”表示供试菌生长一般，受抑制性不显著；“+-”表示供试菌受抑制性较为显著；“-”表示供试菌受抑制性极为显著；“--”表示供试菌完全受抑制，无生长迹象。

3 讨论与结论

本实验采用水蒸气蒸馏法提取香榧叶精油，用气相色谱-质谱联用的方法，进行香榧叶精油的化学成分分析，确认了40种成分，主要为烯萜类物质，其相对质量分数较大的组分有7种，分别是柠檬烯(24.75%)、α-蒎烯(15.26%)、β-蒎烯(9.19%)、香榧酯(7.95%)、β-谷甾醇(5.42%)、月桂烯(4.02%)、δ-杜松烯(3.47%)。现代生物药理学、化学合成实验表明：柠檬烯具有保鲜防腐、抑菌、抗氧化、抗炎、抗肿瘤、利胆溶石等作用[21]；α-蒎烯、β-蒎烯和月桂烯可作为烃类合成香料的起始原料，也是合成润滑剂、增塑剂等的原料[22]；β-谷甾醇有止咳、祛痰、降胆固醇、抑制肿瘤和修复组织等作用[23]。

抗氧化性是作为香榧植物贮存性及抗氧化物鉴别的评价指标之一，本实验测得香榧叶精油具有较强的清除ABTS+自由基、DPPH自由基和羟自由基的能力，且在相同浓度下，香榧叶精油的清除能力要强于维生素C。王焕弟等[24]研究发现，4-羟基肉桂醛、对羟基苯甲醛、松柏醛、4-甲氧基邻苯二酚、胡萝卜苷和β-谷甾醇在香榧的抗氧化活性中起着重要作用。本实验鉴别出香榧叶精油中含有对羟基苯甲醛和β-谷甾醇，其抗氧化性可能与此有关，但具体的作用机制，以及其他成分是否也有抗氧化性，有待于进一步的研究。

由于食品在生产、运输、销售等环节易受微生物的侵染，导致食品变质腐败。香榧叶精油具有较强的抑菌作用，可应用于食品工业中，有效保持食品的新鲜度，延长食品的保质期[25]。Pragadheesh等[26]研究发现，起抑菌作用的主要是精油中的易挥发的成分，使得菌体细胞质凝集和菌丝裂解死亡，其脂溶性也使得更容易透过细胞膜，从而产生抑菌作用。本实验结果表明，香榧叶精油的抑菌作用显著，且对真菌的抑菌效果强于细菌，其中黑曲霉菌、蜡样芽胞杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的最低抑菌质量浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.6、0.8、0.8 mg/mL。