不同预处理方式对海南山柚油感官特性及抗氧化抑菌作用的影响

郭海阳 谭海生 杨劲松 郑小燕 盛占武

(海南大学食品科学与工程学院1，海口 570228)(海南大学材料科学与工程学院2，海口 570228)(中国热带农业科学院海口实验站3，海口 570102)

油茶(CamelliaoleiferaAbel)，又名茶子树、茶油树，为山茶科(Theaceae)山茶属(CamelliaL.)植物，是我国特有的一种极其珍贵的油料木本植物，种植、栽培历史悠久，与油橄榄、油棕、椰子并称为世界四大木本油料树种[1-3]。在海南，油茶通常被称为山柚，其籽所制得的油脂被称为山柚油。海南山柚虽属茶油中的一种，但是由于海南岛独特的地理环境，产出了品质优良的山茶籽，山柚油的特性有别于内地，尤其口感和品质较为特殊，其价格也是内地油茶籽油的5～10倍[4]。冯棋琴等[5]采用顶空取样GC-MS联用技术发现山柚油主要挥发性风味成分含量与内地山茶油区别较大，山柚油中含量最高的为壬醛，且庚醛、1-辛烯-3-醇、正辛醛、2-正戊基呋喃、1-庚醇含量明显高于内地山茶油。

山柚油中的主要成分是油酸，所占总质量分数高达75%左右，脂肪酸的组成也与橄榄油十分相似，而且山柚油中富含多种橄榄油中没有的物质，如茶皂素、茶多酚等，具有降低胆固醇和防辐射等作用[6]。据李丽等[7]的研究，山柚油中不皂化物含量少，易消化吸收，含有丰富的生育酚，对人体中枢神经系统、心血管系统、维持骨骼肌结构和功能以及促进生育功能、增强机体免疫能力等方面都具有积极作用。根据陈梅芳等[8]的研究，茶油还能够降低血脂、肝脂，并显著延缓动脉粥样硬化，对人体健康十分有益。山柚油营养成分含量丰富，而且还有很高的药用价值，对消肿、止痒、刀伤、烫伤、撞伤有功效[9，10]。

油茶籽经过烘烤、焙炒、微波等预处理，自身含有的蛋白质、糖类、油脂在高温有氧气条件下会发生一系列化学反应，加工工艺对山柚油的风味、品质和抗氧化活性有显著影响。目前对山柚油的研究仅集中在其理化特性和组分分析上，对山柚油的抑菌功能及抗氧化功能特性研究甚少，而且鲜有关于预处理方式对山柚油品质影响的研究。选择适宜的预处理方法对优化山柚油的提取工艺，提高茶油品质十分必要[11]。因此，本研究采用焙炒、烘烤、微波等预处理方法处理油茶籽，经压榨所得的山柚油通过DPPH法、ABTS法以及羟基自由基清除率的测定，来分析评价经过不同预处理的山柚油的抗氧化能力差异，以找出最适合山柚油的预处理方式，为今后海南油茶籽高值化加工技术的发展和高品质、高附加值山柚油产品的开发提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

山柚籽：产自海南，含水量10%，含油量30%～40%。

ABTS[2，2-联氮-二(3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸)二胺盐]、DPPH(1，1-二苯基-2-三硝基苯肼)；二甲基亚砜、异丙醇等均为化学纯；其他试剂均为分析纯。

大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙门氏菌(Salmonella)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)：海南大学微生物实验室保藏菌株。

1.2 仪器与设备

LTP205家用小型榨油机；WG70CTL20II-K6微波炉；KWS1530X-H7R格兰仕电烤箱；APY-01大功率电磁炉；SW-CJ-17-D超净工作台；SKP-01电热恒温培养箱；UV-1100紫外可见分光光度计。

1.3 方法

1.3.1 山柚油茶籽的预处理及榨油流程

称取200 g经干燥脱壳后的山柚籽，平均分为4份，参考龙婷等[12]的方法，山柚分别进行焙炒、烘烤、微波处理，以未处理的山柚为未处理组，具体工艺流程：

焙炒处理：焙炒(将油茶籽在150 ℃下焙炒15 min，焙炒时注意避免油茶籽被炒糊、炒焦)→碾碎→压榨→山柚油。

烘烤处理：烘烤(将油茶籽置于烘箱中，于120 ℃下烘烤30 min)→碾碎→压榨→山柚油。

微波处理：微波(频率2 450 MHz，功率700 W，间歇微波5次，每次2 min)→碾碎→压榨→山柚油。

未处理(未处理组)：碾碎→压榨→山柚油。

1.3.2 山柚油的感官评定方法

参考植物油感官分析方法[13]，结合山柚油的感官特点，分别从山柚油的色泽、香味、透明度、黏度对茶油进行感官评价。选择30名具备相关专业知识的人员组成感官评定小组，并对成员进行感官分析培训。评价过程采取双盲实验方法，不告知主试实验目的及茶油展示顺序，对每个评价员按随机顺序展示经过不同预处理的茶油，避免主试效应对实验结果产生影响，按表1进行感官评定。

表1 山柚油感官评分表

1.3.3 山柚油的抗氧化活性测定

1.3.3.1 山柚油清除DPPH·自由基能力的测定

首先选取新鲜榨好的山柚油使用无水乙醇进行梯度稀释，将纯山柚油稀释至4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL。再准确称量0.039 4 g DPPH·用无水乙醇定容至100 mL，再用无水乙醇稀释为1×10-4mol/L的DPPH·溶液。利用溶液的特征紫红色团在517 nm处的吸收峰，使用紫外可见分光光度计测定加入山柚油后A517吸收的下降表示茶油对有机自由基的清除能力，反应总体积为4 mL[14]。将不同浓度的样品分别取2.0 mL，与配制好的DPPH溶液等量混合，避光放置30 min进行反应，以无水乙醇作为参比溶液测定517 nm波长下的吸光度的变化。并按照公式对抗氧化物质的抑制率进行计算：

式中：A0为DPPH·与无水乙醇混合溶液在517 nm的吸光度；Ai为DPPH·与山柚油避光反应30 min后的溶液在517 nm的吸光度；Aj为山柚油与无水乙醇混合溶液在517 nm处的吸光度。最后再根据测得的I来制作一元回归方程以求得样品对DPPH的半抑制浓度(IC50)。山柚油的抗氧化能力通过半抑制浓度IC50来表示，IC50越小，抗氧化能力越强。

1.3.3.2 山柚油对ABTS+·清除能力的测定

参考杨少辉等[15]的方法并稍加改进，将7.0 mmol/L ABTS溶液与2.45 mmol/L过硫酸钾溶液等量混合，置于暗处反应12 h得到ABTS+·。使用甲醇稀释ABTS+·溶液，直到ABTS+·溶液在734 nm处吸光度为(0.70±0.02)。使用甲醇梯度稀释山柚油样品，配制成4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL的山柚油-甲醇溶液，取25 μL不同浓度的山柚油-甲醇溶液加入到2 mL的ABTS+·溶液中，静置混合6 min后测量混合液在734 nm处的吸光度(Ai)。将25 μL甲醇溶液与2 mLABTS+·溶液中，静置加入到ABTS混合6 min后测量混合液在734 nm处的吸光度(A0)。最后取2 mL甲醇溶液与25 μL样品溶液混合，静置6 min后测量混合液在734 nm处的吸光度(Aj)。重复测定3次，按照公式对抗氧化物质的抑制率进行计算：

式中：A0为甲醇溶液与ABTS+·溶液混合后在734 nm处的吸光度；Ai为山柚油-甲醇溶液与ABTS+·溶液混合后在734 nm处的吸光度；Aj为甲醇溶液与山柚油-甲醇溶液混合后在734 nm处的吸光度。

根据所测得的抑制率来制作一元回归方程，计算出抑制率在50%时的用量，即半抑制浓度(IC50)。以质量浓度0.02 mg/mL的VC溶液为参照，通过比较二者的IC50的值来计算样品相当于VC的用量，即VC当量(mg/mL VC)[16]。

1.3.3.3 山柚油对羟基自由基清除能力的测定

根据芬顿反应(Fe2++H2O2→Fe3++OH-+OH·)，用亚铁离子作为催化体系，用双氧水作为氧化剂的氧化反应体系，可以在反应中生成羟基自由基，根据与水杨酸-乙醇反应体系的氧化情况，确定待测样品能否对羟基自由基产生清除效果。在化学反应过程中，二价铁离子被其氧化成三价铁离子可能发生混凝反应从而生成沉淀[17]。测定步骤：

1)使用无水乙醇将4种不同预处理的山柚油进行梯度稀释，配制成4.0、8.0、12.0、16.0、20.0 mg/mL的山柚油-无水乙醇溶液；

2)准确称量0.083 4 g七水合硫酸亚铁，用少量蒸馏水溶解，然后转移至50 mL容量瓶中用蒸馏水定容，以制备6.0 mmol/L硫酸亚铁溶液；

3)准确称量0.041 4 g水杨酸，用少量无水乙醇溶解，然后转移至50 mL容量瓶中用无水乙醇定容，以制备6.0 mmol/L的水杨酸-乙醇体系；

4)用移液枪准确量取30%浓度双氧水溶液167 μL，转移至50 mL容量瓶中用蒸馏水定容，以制备0.1%的双氧水溶液；

5)按顺序在10 mL试管中加入1 mL 6.0 mmol/L水杨酸-无水乙醇溶液，1 mL 6.0 mmol/L硫酸亚铁溶液，不同浓度的茶油-无水乙醇溶液，最后加入0.8 mL双氧水溶液，摇匀后放置于37 ℃恒温水浴锅中反应30 min后离心，在3 500 r/min速度下离心10 min，取上清液在510 nm处测定其吸光度值，以无水乙醇取代双氧水为对照组，以无水乙醇取代山柚油-乙醇溶液为空白组，重复测定3次。按公式对抗氧化物质的抑制率进行计算：

式中：A0为无水乙醇代替山柚油-无水乙醇溶液的吸光度；Ai为山柚油-无水乙醇溶液反应后的溶液的吸光度；Aj为无水乙醇代替双氧水对照组的吸光度。

1.3.3.4 山柚油不同预处理自由基清除能力的显著性分析

采用SPSS 22.0软件对不同预处理方式的自由基清除能力进行t检验分析。

1.3.4 山柚油的抑菌功能测定

1.3.4.1 培养基的制备

牛肉膏蛋白胨培养基的制备：取牛肉膏3.0 g，蛋白胨10.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂粉20.0 g用蒸馏水将溶质摇动溶解，定容至1 000 mL后调pH至7.4～7.6，高压蒸汽灭菌后进行倒平板操作，最后冷却，放至4 ℃冷藏备用。

马铃薯淀粉培养基的制备：取39.0 g真菌用琼脂培养基，用蒸馏水将溶质摇动溶解，定容至1 000 mL后调pH至7.4～7.6，高压蒸汽灭菌后进行倒平板操作，最后冷却，放至4 ℃冷藏备用。

1.3.4.2 山柚油的稀释

用5%无菌吐温-80溶液将山柚油配制成体积分数为5%的山柚油母液。将母液稀释10倍，然后连续采用7次二倍稀释法，最终形成相当于母液浓度0.1×20、0.1×2-1、0.1×2-2、0.1×2-3、0.1×2-4、0.1×2-5、0.1×2-6、0.1×2-7的山柚油溶液[18]。

1.3.4.3 菌悬液的制备

将已活化的菌株分别取1.0 mL菌液入9.0 mL无菌水中，得到浓度为1×10-1的菌悬液置于振荡器上振荡1 min, 取该悬液菌1.0 mL入9.0 mL无菌水中，得到浓度为1×10-2的菌悬液，依次进行梯度稀释，稀释成浓度为1×10-3、1×10-4、1×10-5、1×10-6的菌悬液。

1.3.4.4 山柚油最低抑菌浓度(MIC)的测定

分别选取浓度为1×10-3、1×10-4、1×10-5的菌悬液进行涂布操作，涂布后，在每个平板中放置1个已灭菌的牛津杯，向其中注入50 μL稀释过的山柚油，每个牛津杯中注入1种浓度的山柚油，小心将平板移至培养箱中放置，其中，大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙门氏菌(Salmonella)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)，放置在37 ℃培养箱中培养，放置8 h后，每隔1 h观察1次，测定抑菌圈大小。黑曲霉(Aspergillusniger)放置在28 ℃培养箱中培养，放置32 h后，每隔1 h观察1次，测定抑菌圈大小。

2 结果与分析

2.1 山柚油感官分析评定结果与分析

将各预处理山柚油各项指标进行综合评分，焙炒、烘烤、微波、未处理几种山柚油的分数分别为3.49、3.80、4.11、3.14，可见，微波处理的综合评分最高，并且对山柚进行适当的预处理有助于增加山柚油的风味。

图1 不同预处理方式所得山柚油的感官评价的QDA图

采用定量描述分析法(QDA)对感官品质进行分析，结果见图1，经过焙炒的山柚油虽然在黏度、色泽、透明度这几方面评分略低，甚至低于未处理组的得分，但是其气味和滋味的得分最高，经过焙炒处理之后，山柚油表现出了一种特殊的香气和滋味，并且呈现出的奶油味和坚果味相较其他几种油更丰富，而且表现出的青草味、酸败味等令人不愉悦的味道更淡。山柚在焙炒过程中，由于焙炒条件最为强烈，山柚的细胞壁被迅速破坏，由生变熟，香味得到释放，因此香气和滋味更为浓郁，但也由于其处理条件过于强烈，结构被破坏，导致榨得的山柚油色泽、透明度的得分均相对于未处理组有所下降。经过微波预处理的山柚油，各项指标均相对未处理组有较大提升，是一种优秀的山柚油预处理方法。

2.2 山柚油抗氧化性测定结果与分析

2.2.1 山柚油对DPPH·自由基清除能力的结果分析

经过不同预处理的山柚油对DPPH·自由基清除能力对比如图2所示，山柚油无论是否进行预处理均有清除DPPH·自由基的能力，而且清除DPPH·自由基的能力与山柚油浓度之间存在明显的正量效关系，自由基清除效果随着浓度的增加而增强。但比较发现，经过焙炒处理的山柚油DPPH·自由基清除能力在高浓度时更为显著，而微波处理和烘烤处理则无明显差异，但经过预处理的山柚油清除自由基能力其他均高于未处理的山柚油。说明无论何种预处理方式均能提升山柚油清除DPPH·自由基的能力。

图2 不同预处理方式的山柚油清除DPPH·自由基能力对比

表2 不同预处理方式的山柚油的抗氧化活性比较(DPPH·法)

由表2比较，由于半抑制浓度越低，抗氧化能力越强，因此可以发现山柚油具有较强的抗氧化能力，且抗氧化效果焙炒处理最好，微波处理略优于烘烤处理。但经过预处理的山柚油的抗氧化均明显优于未经过预处理的山柚油。

2.2.2 山柚油对ABTS+·自由基清除能力的结果分析

由图3分析可以看出，3种经过预处理的山柚油对ABTS+·自由基清除能力明显高于未经过预处理的山柚油，且清除ABTS+·自由基能力随着山柚油浓度升高而变强，两者之间存在明显的正相关关系。且预处理能明显提升山柚油的抗氧化能力。

经过表3数据分析比较可知，根据半抑制浓度越低，样品抗氧化性越强的原理，经过焙炒预处理的山柚油抗氧化能力最好，经烘烤预处理的次之，经过微波预处理的最弱，但抗氧化能力均高于未处理组，说明山柚油具有良好抗氧化能力，且适当的预处理能显著提高山柚油的抗氧化能力。

图3 不同预处理方式的山柚油清除ABTS+·自由基能力对比

表3 不同预处理方式的山柚油的抗氧化活性比较(ABTS法)

图4 不同预处理方式的山柚油对羟基自由基清除能力对比

2.2.3 山柚油对羟基自由基清除能力的结果分析

根据图4可以发现，山柚油对羟基自由基清除能力随浓度加大而升高，且经过预处理的山柚油清除羟基自由基能力明显好于未经过预处理的山柚油，说明预处理能明提升山柚油对羟基自由基的清除能力。

根据表4进行分析，半抑制浓度越低，则抑制效果越强，因此可以发现经过焙炒预处理的山柚油清除羟基自由基能力最好，其次是烘烤处理，再次是微波处理，未经过预处理的山柚油清除羟基自由基能力最弱，说明适当的预处理能提高山柚油对羟基自由基的清除效果。

表4 不同预处理方式的山柚油的抗氧化活性比较(羟基自由基清除法)

2.3 山柚油对各自由基清除能力的差异性分析

利用SPSS统计软件，应用t检验对不同预处理方式进行显著性差异分析。

由表5可以看出，经过预处理的山柚油对DPPH的清除效果与未处理(对照组)相比较P值均小于0.01，表明差异非常显著，且经过预处理的山柚油DPPH自由基清除效果均显著高于未处理组的山柚油，其中焙炒处理及烘烤处理之间差异不显著，焙炒处理与微波处理之间差异显著，烘烤处理与微波处理之间差异不显著。

由表6可以看出，经过预处理的山柚油对ABTS自由基的清除效果均显著高于未处理组的山柚油，焙炒处理与烘烤处理得到的ABTS抑制率差异显著，焙炒处理与微波处理得到的ABTS抑制率差异显著，烘烤处理与微波处理得到的ABTS抑制率之间差异不显著，并且经过焙炒处理的ABTS自由基清除效果显著高于烘烤处理和微波处理。

由表7可以看出，经过预处理的山柚油对羟基自由基的清除效果均显著高于未处理组，烘烤处理与微波处理之间无显著差异，焙炒处理显著高于烘烤处理和微波处理的抗氧化性。

由表5～表7可以看出，经过预处理的山柚油的抗氧化性均显著高于未处理组山柚油的抗氧化性，焙炒处理山柚油的抗氧化性显著优于烘烤及微波处理组山柚油的抗氧化性，烘烤处理及微波处理的山柚油的抗氧化性无明显差异。

表5 DPPH自由基清除率差异性分析

注：P<0.05时差异显著，P<0.01时差异极显著,余同。

表6 ABTS自由基清除率差异性分析

表7 羟基自由基清除率差异性分析

2.4 山柚油抑菌效果实验结果与分析

采用牛津杯法，以抑菌圈直径大小为指标，研究山柚油对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、李斯特菌及黑曲霉的抑制效果。最终仅有沙门氏菌存在直径大小为22.0 mm的抑菌圈，说明山柚油对沙门氏菌存在抑制效果，且山柚油对沙门氏菌的最低抑菌浓度为 0.62%。山柚油对其他4种菌均没有表现出抑菌效果。

3 结论

本研究通过感官评定的方法，并借助定量描述分析法得出合理的预处理有利于山柚油的感官特性，并最终确定最有利于山柚油感官指标的预处理方式是微波处理。通过DPPH法、ABTS法及测定羟基自由基清除率3个方法对山柚油的抗氧化特性进行综合评定，最终发现进行有效的预处理均能增强茶油的抗氧化能力，其中焙炒处理效果很好，烘烤处理与微波处理差异不显著，但均显著高于未处理的山柚油。通过牛津杯法测定山柚油对大肠杆菌(Escherichiacoli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、李斯特菌(Listeriamonocytogenes)、沙门氏菌(Salmonella)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、黑曲霉(Aspergillusniger)的抑菌效果，发现山柚油仅对沙门氏菌存在显著的抑制效果。本研究结果表明适当的预处理能明显提升山柚油的感官特性及抗氧化效果，油茶籽在适当的预处理(焙炒、烘烤、微波)过程中发生美拉德反应产生丰富的风味物质，提高了山柚油的感官品质，且微波预处理是从综合角度考量最适合山柚油的预处理方式。