超声辅助酶解法提取亚麻籽油的工艺

高瑞苑 尹三毛 李志英 张海容

(忻州师范学院化学系，忻州 034000)

亚麻籽俗称胡麻籽，是亚麻科的一年生或多年生草本植物亚麻的种子，其中含有不饱和脂肪酸，以及蛋白质、膳食纤维、维生素、微量元素等多种对人体有益的成分，适用于人体保健[1，2]。亚麻籽中含油率达35%～48%，亚麻籽油中不饱和脂肪酸的质量分数达80%以上，并且富含α-亚麻酸、维生素E、类黄酮[2，3]。α-亚麻酸是人体的一种必需脂肪酸，具有丰富的药理作用[4，5]，在体内能转化成DHA，对智力和神经系统发育大有裨益。

目前，国内外亚麻籽油的提取方法主要有压榨法、溶剂浸提法、生物酶法、超临界萃取法等[6，7]。压榨法分为冷榨和热榨，压榨全过程无任何化学添加剂，但冷榨法出油率低，热榨相对于冷榨法出油率较高，但油色泽较暗。溶剂浸提法提油率较高，多利用有机溶剂，溶剂用量较大，增加加工成本[6]。超临界萃取需要在高压的条件下进行，这对设备及工艺技术的要求极高，也使生产成本增加[7]。生物酶法提油是最近油脂工业的研究热点，本实验通过酶解将组织结构和大分子物质破坏，再利用超声波辅助法进一步破坏细胞组织，使细胞中的游离油流动性增强，从而提高提取率[8]。

本实验利用纤维素酶和碱性蛋白酶将亚麻籽细胞壁、多糖及脂蛋白分解，在此基础上，利用超声波辅助进一步将亚麻籽细胞组织结构破坏，使油脂能够充分的溶出[9]。结合酶本身的特点及超声波的使用条件，确定料液比、加酶量、保温温度、保温时间、pH、超声时间及超声功率作为单因素考察变量，以亚麻籽油得率为响应值，采用Box-Behnken响应面分析法，对影响较大的因素：料液比、加酶量、保温温度、pH、超声时间进行分析，确定最佳的提取条件，以期优化亚麻籽油提取工艺。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

亚麻籽：产地为山西省神池县烈堡乡；碱性蛋白酶，酶活力 200 U/mg；纤维素酶，酶活力50 U/mg；果胶酶：3 000 000 U/g；正己烷、氢氧化钠、盐酸均为分析纯。

1.2 实验仪器

100Y多功能粉碎机；pHS-3C酸度计；TDL-40B离心机；HH-6SH数显恒温水浴锅；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器；RE-52AA旋转蒸发器。

1.3 实验方法

1.3.1 超声酶法提取亚麻籽油的工艺流程

亚麻籽原料→脱胶→烘干→粉碎过筛(60目)→加沸水→调节pH→加酶→超声→保温浸提→离心分离(4 000 r/min，10 min，取上清液)→萃取(取上层液体)→旋蒸→亚麻籽油。

1.3.2 脱胶处理方法

首先对亚麻籽进行脱胶处理[10]，先清理掉亚麻籽中的空壳，碎粒，发霉的种子，以及石子、杂草等杂质。取处理好的亚麻籽500 g置于烧杯中，加入3 g果胶酶，水浴加热到40 ℃，搅拌均匀，保温30 min，用纱布过滤，除去亚麻籽表面的胶，再用40 ℃的清水清洗几次，充分将亚麻籽表面的胶去除。放入干燥箱中60 ℃下烘干，粉碎，得亚麻籽粉末。

1.3.3 亚麻籽油提取及得率计算方法

取15 g脱胶后的亚麻籽粉末，加入一定量的沸水，搅拌均匀。待料液冷却后，调节至所需pH。加入碱性蛋白酶，水浴保温十分钟，再加入纤维素酶，超声。然后4 000 r/min下离心10 min，取上清液，用正己烷萃取，旋蒸，得亚麻籽油，干燥、称重。

1.3.4 单因素实验

考察料液比、加酶量、提取温度、酶解pH、超声时间、超声功率各自对亚麻籽油得率的影响。选取料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25，加酶量0.05、0.1、0.15、0.2、0.25 g，提取温度30、40、50、60、70 ℃，酶解pH 4、5、6、7、8、9、10、11，超声时间10、20、30、40 min，超声功率160、240、320、400 W，进行单因素考察实验，通过计算亚麻籽油得率，确定响应面分析实验范围，进而优化提取亚麻籽油的工艺条件。

2 结果与分析

2.1 单因素实验

2.1.1 料液比对亚麻籽油得率的影响

准确称取亚麻籽粉末15 g，分别按料液比1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25加入煮沸的蒸馏水，不断搅拌，待料液冷却，再加入碱性蛋白酶和纤维素酶各0.15 g，提取温度40 ℃，超声时间10 min，超声功率200 W，条件下提取，得到料液比对亚麻籽油得率的影响如图1所示。

图1 料液比、加酶量、提取时间对亚麻籽油得率的影响

由图1可知，亚麻籽油得率随料液比的增加而增加，当料液比超过1∶10后提油率增长缓慢，可能原因是随着料液比的增加，酶与亚麻籽原料能够充分接触，酶解更加充分，使油脂更易溶出，随着料液比继续增加时，因为酶解作用有限，亚麻籽油得率增加不明显[11]。故选择合适的料液比为1∶10。

2.1.2 加酶量对亚麻籽油得率的影响

准确称取亚麻籽粉末15 g，加入150 mL沸水，不断搅拌，待料液冷却，分别加入碱性蛋白酶和纤维素酶各0.05、0.10、0.15、0.20 g，在超声时间10 min，超声功率200 W，提取温度40 ℃，条件下提取，得到加酶量对亚麻籽油得率的影响如图1所示。

由图1可知，随着加酶量的增加，亚麻籽油得率增加，但是在超过0.1 g以后，得率开始下降。可能原因是，随着加酶量的增加，酶水解细胞组织的效果增加，使得细胞中的大分子蛋白质、糖类等水解彻底，有利于细胞内油脂的释放，从而亚麻籽油的得率增加，随着加酶量的继续增加，料液中酶解后产生的小分子成分增加，使得游离的油脂与料液不易分离彻底，从而使得亚麻籽油得率降低[12]。故选择合适的加酶量为0.10 g。

2.1.3 提取温度对亚麻籽油得率的影响

准确称取亚麻籽粉末15 g，加入150 mL沸水，不断搅拌，待料液冷却，分别加入碱性蛋白酶和纤维素酶各0.10 g，在超声时间10 min，超声功率200 W，提取温度为30、40、50、60、70 ℃，条件下提取。得到不同提取温度对亚麻籽油得率的影响如图1所示。

由图1可知，随着温度的升高亚麻籽油的得率增加，但在超过50 ℃以后，得率开始下降，可能原因是，纤维素酶和碱性蛋白酶的最适温度45 ℃，在达到酶活性的最适温度之前，随着温度的升高，酶活性增加，酶解作用增强，亚麻籽油得率增加，但在超过酶活性的最适温度后，酶的活性开始降低，导致亚麻籽油的得率下降[13]。故选择合适的提取温度为50 ℃。

2.1.4 酶解pH对亚麻籽油得率的影响

准确称取亚麻籽粉末15 g，加入150 mL沸水，不断搅拌，待料液冷却，调节pH为4、5、6、7、8、9、10、11，加入碱性蛋白酶和纤维素酶各0.10 g，在超声时间10 min，超声功率200 W，提取温度50 ℃，条件下提取，得到酶解pH对亚麻籽油得率的影响如图2所示。

图2 酶解pH、超声时间、超声功率对亚麻籽油得率的影响

由图2可知，pH由4～6时，纤维素酶发挥主要作用，随着pH的升高亚麻籽油的得率增加，这与纤维素酶的活性随pH变化有关，pH为6时，纤维素酶活性最大。pH由7～10时，碱性蛋白酶发挥主要作用，随着pH的升高亚麻籽油的得率增加，这与碱性蛋白酶的活性随pH变化有关，pH为10时，碱性蛋白酶活性最大，pH超过10以后，碱性蛋白酶活性下降，得率下降，pH通过影响酶的活性进而影响亚麻籽油的得率[6]。故选择合适的酶解pH为10。

2.1.5 超声时间对亚麻籽油得率的影响

准确称取亚麻籽粉末15 g，加入150 mL沸水，不断搅拌，待料液冷却，调pH至10，加入碱性蛋白酶和纤维素酶各0.10 g，在超声功率200 W、提取温度50 ℃，改变超声时间20、30、40、50 min，条件下提取，得到超声时间对亚麻籽油得率的影响如图2所示。

由图2可知，随着超声时间的升高亚麻籽油的得率增加，但在超过40 min以后，得率开始下降，可能原因是，随着超声时间的增加，细胞组织被破坏的更加充分，有利于酶解的进一步作用，使得游离油流动性增强，更易溶出，从而提高了亚麻籽油的得率，随着超声时间的继续增加，细胞释放油脂分子的速度和油脂分子的扩散速度达到动态平衡，游离油与料液的混合度增加，使得游离油的分离困难，造成部分油脂难以彻底分离，使得亚麻籽油的得率降低[14]。故选择合适的超声时间为40 min。

2.1.6 超声功率对亚麻籽油得率的影响

准确称取亚麻籽粉末15 g，加入150 mL沸水，不断搅拌，待料液冷却，调节pH至10，分别加入碱性蛋白酶和纤维素酶各0.10 g，在超声时间40 min，提取温度50 ℃，改变超声功率160、240、320、400 W，条件下提取，得到超声功率对亚麻籽油得率的影响如图2所示。

由图2可知，随着超声功率的升高亚麻籽油的得率增加，但在超过240 W以后，得率开始下降，可能原因是，随着超声功率的增加，细胞组织被分解的更加彻底，细胞组织释放油脂分子的速度和油脂分子的扩散速度不断增加，当达到一定值后达到动态平衡，油脂的产量不再增加，但随着超声功率的继续增加，亚麻籽细胞结构破坏更加彻底，亚麻籽颗粒粉末度加大，这就增加了混合油分离的难度和部分油脂的损耗，使得亚麻籽油的得率降低[15]。故选择合适的超声功率为240 W。各单因素实验除超声功率外，不同条件对亚麻籽油得率的影响范围在3.11%～12.87%之间，不同超声功率对亚麻籽油得率的影响范围为2.43%<3.11%，因此，超声功率没有列入响应面因素中。

2.2 响应面分析

2.2.1 响应面实验设计及结果

在单因素实验基础上，利用Box-Behnken中心组合实验设计原理，采用Design-Expert软件设计五因素三水平的响应面分析实验。选择料液比(A)、加酶量(B)、提取温度(C)、酶解pH(D)、超声时间(E)为自变量，亚麻籽油得率(Y)为响应值。响应面因素水平及编码见表1，响应面实验设计及结果见表2。

表1 响应面实验设计因素水平及编码

表2 响应面实验设计及结果

续表2

对表2中的实验数据进行多元回归拟合，得到亚麻籽油得率的多元二次回归方程:Y=30.51+0.63A-0.26B-0.20C+1.07D-0.40E+0.008 833AB-0.52AC+0.84AD-0.23AE-0.81BC+0.20BD+0.14BE+0.060CD-0.22CE+0.46DE-3.65A2-2.38B2-3.59C2-3.43D2-2.39E2。回归模型的显著性检验及方差分析见表3。由表3可知，模型P<0.000 1，差异极显著，表明响应值与参考变量之间存在极显著的关系。模型的相关系数R2=0.954 8，说明模型响应值的95.48%取决于参考变量，所以该模型拟合度良好。信噪比(Adep Precision=18.288)大于4说明回归方程的可信度较高。变异系数等于2.67，说明模型稳定性较好。因此，响应面法优化酶解法提取亚麻籽油工艺可靠、稳定性好，得到的回归方程能较好地预测实验结果。

表3 回归模型显著性检验及方差分析

注：P<0. 001为差异极显著水平；0.001

从回归方程模型因变量的方差分析可知，模型的一次项A、D对响应值的影响极显著，E对响应值的影响显著；交互项影响不显著；二次项A2、B2、C2、D2、E2对响应值的影响显著；失拟项P>0.05，差异不显著。根据F值大小可知各因素对亚麻籽油得率的影响顺序为D>A>E>B>C，即酶解pH>料液比>超声时间>加酶量>提取温度。

2.2.2 最优提取工艺的确定

对多元二次回归方程求一阶偏导，得到在料液比1∶10.5，加酶量0.10 g，提取温度49.7 ℃，酶解pH 10.2，超声时间 39 min的条件下，亚麻籽油得率最大为30.53%。结合实际的仪器条件，以及实验具体操作的可行性，修正为料液比1∶10.5，加酶量0.10 g，保温温度50 ℃，酶解pH 10，超声时间 40 min，在修正后的实验条件下，进行3次验证实验，所得亚麻籽油的得率为(30.52±0.04)%，与理论值30.57%接近，实验值与理论值基本吻合，表明模型误差小、可靠。

3 结论

响应面实验得到亚麻籽油得率与各因素的二次方程模型为：Y=30.51+0.63A-0.26B-0.20C+1.07D-0.40E+0.008 833AB-0.52AC+0.84AD-0.23AE-0.81BC+0.20BD+0.14BE+0.060CD-0.22CE+0.46DE-3.65A2-2.38B2-3.59C2-3.43D2-2.39E2该模型回归显著，对实验拟合较好，有一定的实用价值。

通过单因素实验和响应面优化亚麻籽油的酶解法提取工艺后，得到酶解法提取亚麻籽油的最优工艺条件为：料液比 1∶10.5、加酶量 0.10 g、提取温度 50 ℃、酶解pH 10、超声时间 40 min，在该条件下所得亚麻籽油的得率为30.52%，所得的油品质好，为透明金黄色。

采用超声辅助酶解法提取亚麻籽油的方法，与传统压榨方相比，外观及稳定性方面更好。与溶剂浸提法相比，该方法过程简单，耗时短。与CO2超临界萃取相比，该方法设备简单，成本低。