β溶血表型摩根摩根菌的鉴定及系统发育树构建

贾琴妹 满宝华

摩根摩根菌（Morganella morganii，M.morganii）是肠杆菌科摩根菌属（Morganella）的唯一菌种，常寄生于人和动物的肠道，为人体肠道正常菌群的重要成员之一，广泛分布于自然界及医院环境中，属条件致病菌。其主要引起泌尿道感染和伤口感染，其他部位感染少见[1]，但近几年国内外均有文献报道其引起菌血症、脑膜炎、关节炎、心包炎和眼内膜炎等[2-3]。摩根摩根菌的生物学特性是兼性厌氧，对营养要求不高，在营养琼脂和血琼脂上均可生长，约有50%的菌株在血琼脂上产生α溶血[4]。本文将报道一株从中段尿中分离培养及鉴定出的β溶血摩根摩根菌，以及基于16S rDNA的系统发育树构建，从而提高扩充医务人员对β溶血摩根摩根菌的认识，及时有效地为感染者诊治。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌株来源

分离出的摩根摩根菌（标本编号：U1901）源于云南省第三人民医院重症医学科（Intensive Care Unit，ICU）某患者中段尿培养。质控菌株大肠埃希菌（ATCC 25922）和摩根摩根菌（ATCC 25830）均购自国家卫健委临床检验中心。

1.2 仪器与试剂

VITEK-2 Compact 全自动微生物鉴定仪及配套鉴定卡、VITEK MS-DS 靶板和VITEK MSCHCA 基质液均购自法国梅里埃公司；CO2培养箱为美国Thermo 公司产品；旋涡混合器VDRTEX-5购自海门其林贝尔仪器制造有限公司；细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒购自生工生物工程（上海）股份有限公司；PCR 扩增仪购自美国PE 公司；电泳仪购自美国Tanon 公司；紫外凝胶成像仪购自上海复日生物技术有限公司。

1.3 菌株的分离培养和连续传代培养

无菌操作采集送检的中段尿样本，接种于血琼脂平板和麦康凯琼脂平板（郑州安图生物有限公司产品），置5% CO2温箱35℃～37℃孵育18～24 h；同样的培养环境，将菌株连续传代培养10次，观察溶血现象。

1.4 菌株的鉴定

1.4.1 VITEK-2 Compact 全自动微生物鉴定仪鉴定

挑取分离出的纯菌落与盐水充分混匀，菌悬液浓度调至（0.5～0.63）麦氏单位；将配套的GN 鉴定卡插入菌悬液中，再转移到鉴定仪中进行扫描上机处理；上机所得的生化反应结果与鉴定仪中高级专家系统（Advanced Expert System，AES）数据库进行比对分析，最终得出鉴定结果。

1.4.2 机制辅助激光解析离子-飞行时间质谱仪（Matrix-assisted Laser Desorption/Ionozation-time of Flight Mass Spectrometry，MALDI-TOF-MS）鉴定

选取分离培养后的纯菌落均匀涂布在质谱仪器特有的96 孔钢板上；而后在涂布细菌的孔上加入1 μL 基质液；待其干燥后放入质谱仪器进行检测，最后将所得的质谱峰图与数据库中峰图进行比较，得出鉴定结果。

1.5 16S rDNA测序及同源性分析

首先采用细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取菌株DNA 模板，操作严格按照试剂盒说明书操作。PCR 扩增引物[5]分别为：F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；R：5′-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3′，PCR 反应体系（50 μL）如下：40.2 μL ddH2O，2 μL 基因组DNA（15 ng/μL）作为模板；0.5 μL 的dNTP（10 mM），5 μL 的10×TaqPCR缓冲液（Mg2+），每条引物（10 pmol/μL）1 μL，0.3 μL rTaq DNA聚合酶（5 U/μL）。PCR扩增条件为：95℃预变性5 min；95℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸50 s、35个循环；72℃补延伸10 min。扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳，同时观察条带大小，并挑取阳性产物回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。最后将测序的结果从NCBI 网站“blast”GenBank 数据库检出与所测菌株16S rDNA 序列同源性较高的序列，判断16S rDNA 基因鉴定结果，同时验证VITEK-2 Compact和MALDI-TOF-MS鉴定结果的正确性。

1.6 系统发育分析

使用Blast 将基因预测得到的16S rDNA 序列与NCBI的16S数据库进行比对，设置参数identify＞95。然后选取identify最高的前30条16S rDNA 序列（不足则全取），并利用Muscle（Multiple Protein Sequence Alignment）软件进行序列多重比对后，采用FastTree 软件构建菌株的系统发育树。

1.7 溶血素（Hemolysin）基因检测

采用细菌基因组DNA 快速抽提试剂盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）提取的DNA 作为模板，根据文献[6]报道合成PCR 引物，包括HlyA、HlyB、HlyC、HlyD引物序列引物序列见表1，PCR反应体系（10 μL）如下：3.2 μL ddH2O，1 μL 基因组DNA（30 ng/μL）作为模板；0.5 μL 的dNTP（10 mM），4 μL 的10×TaqPCR 缓冲液（Mg2+），每条引物（10 pmol/μL）1 μL，0.3 μL rTaq DNA 聚合酶（5 U/μL）。PCR 扩增条件为：94℃预变性3 min；94℃变性1 min、60℃退火1 min、72℃延伸40 s、共进行40个循环。PCR 产物经1%的琼脂糖凝胶电泳，阳性产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

表1 编码溶血素基因引物序列Table1 Primer sequence of hemolysin gene

2 结果

2.1 分离培养情况

血琼脂平板培养基上可观察到单个、中等大小、湿润的灰白色菌落，边缘整齐，无特殊气味，但菌落周围有β溶血环；连续10次传代后，β溶血现象稳定存在，见图1。

图1 细菌在血平板表型特征Figure1 The phenotypic characteristics of bacteria on the blood plate

2.2 VITEK-2 Compact和MALDI-TOF-MS鉴定结果

VITEK-2 Compact 鉴定结果：奇异变形杆菌，可信度99%，见图2。

MALDI-TOF-MS 鉴定结果：摩根摩根菌，可信度99.9%，见图3。

2.3 16S rDNA 测序结果

将菌株测序后获得的序列在GenBank 数据库中进行比对，结果显示与摩根摩根菌摩根亚NBRC 3848 同源性最高，达到99.99%。

图2 质控菌株摩根摩根菌及奇异变形杆菌的GN 鉴定图Figure2 The GN identification results of quality control strain M.morganii and Proteus mirabilis

图3 摩根摩根菌质谱图Figure3 The mass spectrogram of M.morganii

2.4 16S rDNA 测序验证对比

VITEK-2 Compact 鉴定结果（奇异变形杆菌）和MALDI-TOF-MS 鉴定结果（摩根摩根菌）不一致，16SrDNA 测序方法验证结果为摩根摩根菌摩根亚种NBRC 3848。

2.5 基于16S rDNA的同源性分析和系统发育树

使用Blast 将菌株（标本编号：U1901）的16SrDNA 序列与NCBI 的16S 数据库进行比对后发现在该系统发育树上可见，U1901与摩根摩根菌摩根亚种NBRC 3848 形成一个分支，验证可信度达99.99%。见图4。

图4 基于16S rDNA的系统发育树Figure4 The phylogenetic tree based on 16S rDNA

2.6 溶血素（Hemolysin，Hly）基因检测结果

通过对HlyA、HlyB、HlyC、HlyD基因的扩增，HlyB为阳性，其余均为阴性。测序结果显示检出的HlyB与病原菌毒力因子（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria，VFDB）数据库中HlyB有99%同源性。

3 讨论

近几年，随着社会环境和医疗技术水平的逐渐改变，摩根摩根菌的感染部位和检出率在不断增加[7]。由ICU 患者所处的情况可知，本研究中的摩根摩根菌是在众多因素作用压力下存活繁殖，其毒力和耐药率较高。该菌在血琼脂平板上出现典型的β溶血环，随后检测到溶血素（HlyB）基因。与传统摩根摩根菌相比较[4]，此菌具有β溶血现象特征，是摩根摩根菌家族中新增的一个表型。至今为止，可能由于该表型的摩根摩根菌出现较少而未被发现等原因，未查阅到与此表型相关的国内外文献报道。本实验中摩根摩根菌HlyB基因的获得可能是由混合感染的细菌（如：大肠埃希菌O157：H7）间经接合、转导、插入等方式传播而来。溶血素的产生，增强了细菌的致病性。

VITEK-2 Compact 鉴定结果出来后，检查排除了仪器设备、配套使用的材料、操作等无任何问题；也查看分析了细菌无污染情况。随后重复操作多次，鉴定结果均与首次一致。原因可能是VITEK-2 Compact 仪器自身存在局限性（如：AES数据库未更新），也可能是由于菌株的生理生化反应发生了一点偏差，最终均影响鉴定结果的准确性。奇异变形杆菌和摩根摩根菌以前同属肠杆菌科变形杆菌族细菌，后来才成为独立菌属细菌，因此大部分生化反应相同，主要的鉴别试验是硫化氢、鸟氨酸脱羧酶和枸橼酸盐试验[4]，这3个试验中若某个发生一点偏差，均会显示不同的鉴定结果，这可能就是VITEK-2 Compact 鉴定结果不准确的原因所在。但是，目前很多文献都有报道[7-9]VITEK-2 Compact 对传统经典的摩根摩根菌鉴定结果均准确，本实验室也是如此。本研究中MALDI-TOF-MS 方法对β溶血的摩根摩根菌能快速准确完成鉴定。其主要原因是MALDI-TOFMS 技术能直接分析完整的蛋白质分子避免了生化反应结果的偏差及所需的反应时间，弥补了传统的生理生化反应鉴定方法的不足之处。有文献报道[10]，其与全自动微生物鉴定仪的生化反应相比，MALDI-TOF-MS 已经逐步成为一种新型的微生物检测和鉴定技术，并且以其快速、准确、灵敏、高效、低成本、易操作等优势得到快速发展。目前，国内外临床微生物实验室逐渐重视MALDITOF-MS 在微生物领域的应用[11-12]。

16S rDNA 基因序列具有较高保守性、突变率小，分子量大小适中等优点，属于原核生物核糖体小亚基，存在于所有细菌染色体基因组中[13]。序列包含11个恒定区和与之相间的10个可变区。保守区为所有细菌共有，细菌之间无显著差异[14]，可变区因细菌菌种不同而存在差异，因此利用可变区序列的这种差异来对不同种属的细菌进行分类鉴定已被认同且广泛应用。且国际上已逐步认同用原核生物的16S rDNA 序列作为原核生物分类鉴定的标准[15-16]，也是验证其它方法结果的标准，其能准确将未知菌鉴定到种，甚至亚种水平。本文中，16S rDNA 系列测序结果验证了MALDI-TOF-MS 方法能准确鉴定出细菌菌种。

摩根摩根菌虽不是临床常见病原菌，但引起的感染发生率在逐年增加[17]，且对抗菌药物耐药率也在增加。本研究中的摩根摩根菌产溶血素，增加了其致病性。因此，应引起临床医生和微生物检测人员的高度重视，不断提高补充自身知识库，及时对仪器专家数据库进行更新升级，加强医务人员之间有效的沟通，正确合理使用抗菌药物，严格执行消毒隔离措施，减少耐药基因和毒力因子的出现及传播扩散。