分子印迹膜萃取结合高效液相色谱-串联质谱法快速检测牛奶中的痕量环丙沙星残留

田红静, 刘 通, 游 松, 张 峰*

(1. 沈阳药科大学生命科学与生物制药学院, 辽宁 沈阳 110016; 2. 中国检验检疫科学研究院食品安全研究所, 北京 100176)

环丙沙星(ciprofloxacin, CIP), 1-环丙基-6-氟-4-氧代-7-(1-哌嗪基)-1,4-二氢喹啉-3-甲酸,属于第三代喹诺酮类抗生素,具有抗菌谱广、杀菌效果好、价格低廉、简单易得的优点,被广泛应用于动物和人类的多种感染性疾病的治疗[1]。然而,畜牧业中的不合理滥用及误用,会导致一些动物源性产品中存在痕量的环丙沙星残留。长期食用含有环丙沙星残留的食品,可能会造成人体内菌群失衡,耐药菌株产生或人体中枢神经损伤[2],甚至有“三致”风险[3],造成严重的公共卫生问题。针对这种情况,我国及一些其他国家和组织纷纷将环丙沙星列入限制使用的兽药名单,并规定了最大残留限量(MRL)[4]。我国农业部235号公告[5]中规定动物源性食品中环丙沙星和恩诺沙星(ENR)合计的MRL为100 μg/kg,这与欧盟(EU)的相关规定[6]是一致的。考虑到环丙沙星残留的毒副作用,建立一种测定食品中痕量环丙沙星残留的灵敏快速且廉价的分析方法至关重要。

目前已有的食品中喹诺酮类抗生素的检测方法包括微生物检测法[7]、分光光度法[8]、免疫分析法[9]、高效液相色谱法[10]和液相色谱-质谱联用法[11]等。然而,由于食品基质复杂以及环丙沙星残留量较低,通常需要进行繁琐的样品前处理。液液萃取(LLE)[12]、固相萃取(SPE)[13,14]、QuEChERS[15]、基质固相分散萃取[16]是目前应用较多的前处理方法,但难以实现目标物的特异性净化富集,而且操作比较复杂繁琐,因此,开发易操作、高选择性提取痕量环丙沙星的新方法十分必要。

分子印迹聚合物(molecularly imprinted polymers, MIPs)作为一种“人工抗体”,可为模板分子及其结构类似物提供特定的互补结合位点和形状,实现在复杂样本基质中目标分子的特异性提取及富集[17]。MIPs作为固相萃取填料已被应用到食品中抗生素残留的检测[18]。Wang等[19]合成了诺氟沙星分子印迹聚合物,并将其作为固相萃取填料与高效液相色谱联用,检测牛奶中的环丙沙星残留,其吸附能力强(≥4 520 ng),检测回收率高(≥96% ),检出限(LOD)低(10 μg/L)。文献[20]合成了一种蒙脱石磁性分子印迹聚合物(MMMIPs),并将其作为固相萃取材料提取牛奶中4种氟喹诺酮类抗生素,LODs介于12.9和18.8 μg/L 之间。然而,当采用本体聚合方法制备得到MIPs并作为SPE填料,通常需要经过称重、装填、离心等步骤,操作繁琐,耗时较长。为实现较快速检测,采用表面聚合方法,将分子印迹聚合物合成在固相载体上,可作为一种简化的前处理材料,实现复杂食品样品中目标物的快速检测。Yang等[21]在搅拌棒表面涂布双模板分子印迹聚合物,建立了可以同时检测肉中9种喹诺酮类抗生素的搅拌吸附萃取(SBSE)方法,LODs为0.1～0.3 ng/g。Mirzajani等[22]在不锈钢丝上制备了CIP分子印迹聚合物涂层并作为固相微萃取纤维,结合HPLC-UV检测技术可实现血清、血浆和片剂制剂样品中CIP的选择性检测。除搅拌棒和不锈钢丝外,醋酸纤维素[23]、尼龙[24]和聚偏氟乙烯膜(PVDF)[25,26]等多孔膜材料也可以作为分子印迹材料的载体。将MIP合成在多孔膜表面,形成分子印迹膜(MIMs),并将其作为样品前处理材料,可以从复杂样品基质中选择性分离和提取目标化合物,具有化学稳定性好、耐受有机溶剂和成本低的优点。但目前尚未有MIP修饰多孔膜选择性分离提取食品样品中环丙沙星的研究报道。

本研究使用分子印迹膜萃取-高效液相色谱-串联质谱法(MIME-HPLC-MS/MS)测定牛奶中痕量环丙沙星残留。通过我们前期研究发现,MIM存在较严重的模板泄露问题,故使用结构与环丙沙星非常相似的恩诺沙星(结构式见图1)作为伪模板,实现环丙沙星的选择性吸附,可以有效避免模板泄漏问题。并考察了MIM的吸附容量,优化了MIM的提取条件,建立了一种可以快速检测牛奶中痕量环丙沙星的新方法。

图 1 (a)恩诺沙星和(b)环丙沙星的结构式Fig. 1 Structures of the compounds (a) enrofloxacin (ENR) and (b) ciprofloxacin (CIP)

1 实验部分

1.1 仪器、试剂与样品

Spark Holland SYMBIOSISTMPICO在线固相萃取-液相色谱(SPE-LC)仪,配有低压四元泵、自动脱气装置、自动进样器、柱温箱(荷兰Spark Holland公司); AB SCIEX Qtrap 6500三重四极杆串联质谱仪(含电喷雾离子源,美国爱博才思公司);高速冷冻离心机(美国贝克曼公司);超纯水系统(18.2 MΩ·cm,美国默克密理博公司)。

恩诺沙星、环丙沙星、头孢羟氨苄(CFR)、磺胺嘧啶(SDZ)、阿奇霉素(AZI)、氧氟沙星(OFL)(纯度>99% ,德国Dr. Ehrenstorfer公司); PVDF疏水膜(0.45 μm, Φ 13 mm,美国默克密理博公司);甲基丙烯酸(MAA)和乙二醇二甲基丙烯酸酯(EGDMA)(美国Sigma-Aldrich公司);偶氮二异丁腈(AIBN,日本TCI公司);甲酸、乙酸(LC-MS级,美国Fisher Scientific公司);甲醇、乙腈、乙醇、乙酸(HPLC级,德国CNW Technologies公司);丙酮(HPLC级,美国J. T. Baker公司)。

1.2 色谱-质谱检测条件

1.2.1 液相色谱条件

色谱柱:Agilent ZORBAX SB-Aq(150 mm×4.6 mm, 3.5 μm,美国安捷伦科技公司);进样量3 μL;柱温30 ℃;流速0.5 μL/min;流动相A: 0.2%甲酸水;流动相B: 0.1%甲酸乙腈;梯度洗脱条件为0～1.5 min, 90%A; 1.5～2 min内,A相降为50% ; 2～6.5 min内,A相继续下降到20% ;之后到7 min, A相升到90% ;最后保持1 min。

1.2.2 质谱条件

扫描方式:ESI+;检测方式:多反应监测(MRM);电喷雾电压(IS): 5 500 V;雾化气压力(GS1): 379.2 kPa(55 psi);辅助气压力(GS2): 344.7 kPa (50 psi);气帘气压力(CUR): 137.9 kPa (20 psi);离子源温度(TEM): 550 ℃;驻留时间(DT): 100 ms。其他质谱参数见表1。

表 1 CIP和ENR的MRM参数Table 1 MRM parameters for CIP and ENR

* Quantitative ion. CE: collision energy; DP: declustering potential.

1.3 标准溶液配制

准确称取环丙沙星标准品,用乙腈配制成0.1 g/L 的标准储备液,之后准确称取适量环丙沙星标准储备液,用乙腈稀释成10 mg/L 的标准中间液;准确称取适量标准中间液,用初始流动相稀释成0.1、0.2、0.5、1、2、5、10、20、50、100、200 μg/L 系列浓度的标准溶液。

1.4 MIM与NIM的制备

参考文献[26]报道的分子印迹膜制备方法,稍微加以改进,制备过程包括PVDF膜的活化以及分子印迹聚合物吸附PVDF膜两个过程。

1.4.1 PVDF膜的活化

对PVDF膜进行活化是为了去除膜上存在的残留物,活化膜表面的亲水物质。首先将PVDF膜浸入纯水10 min,再浸入乙腈10 min,之后浸入含有0.15 mol/L AIBN的乙腈溶液中20 min,取出后晾干。活化好的膜应迅速放入分子印迹预聚液中。

1.4.2 MIM与非分子印迹膜(NIM)的合成

称取1 mmol的恩诺沙星标准品于棕色试剂瓶中,随后量取6 mmol的MAA功能单体,然后加入15 mL的氯仿-甲醇(5∶1, v/v)混合液,涡旋使之充分混匀,密封,室温预聚合1 h。完成之后量取30 mmol的EGDMA交联剂和2 mmol的AIBN引发剂加入到预聚液中,充分混匀后,加入上述活化好的PVDF膜,超声除氧10 min,密封,室温吸附2 h。反应结束后将膜分装在玻璃瓶中,氮气保护下恒温65 ℃聚合24 h。随后用甲醇-乙酸(9∶1, v/v)混合液做洗脱液,反复洗脱洗去膜上结合的模板分子,至平台期后用纯水洗涤膜表面至中性,然后用乙腈洗涤并干燥,保存于干燥器备用。

NIM的制备过程与MIM的制备过程除不加伪模板分子恩诺沙星外,步骤一致。

1.5 MIM吸附试验

1.5.1 吸附容量考察

取一张MIM和NIM分别放入到2 mL不同质量浓度(10、50、100、200、300、500 μg/L)的环丙沙星标准溶液中,室温振摇吸附20 min。吸附完成后,取吸附后的标准溶液进HPLC-MS/MS检测。通过公式(1)计算平衡吸附容量[26]。

Qe=(C0-Ce)×V/A

(1)

其中Qe(ng/cm2)代表平衡吸附容量;C0(μg/L)代表溶液中待测物的初始浓度;Ce(μg/L)代表溶液中吸附待测物后的浓度;V(mL)代表溶液体积;A(cm2)代表MIM或NIM的面积。

为验证MIM的特异性,选择氧氟沙星、头孢羟氨苄、磺胺嘧啶、阿奇霉素作为环丙沙星的竞争物,每种抗生素的质量浓度均为200 μg/L,于2 mL标准溶液中各加一张MIM和NIM,室温振摇吸附20 min,将吸附后的标准溶液进行HPLC-MS/MS检测。通过公式(1)计算平衡吸附容量,比较MIM和NIM对各吸附物的吸附量;通过公式(2)计算分配系数Kd,评价MIM和NIM两种吸附剂对不同抗生素的吸附效率;通过公式(3)计算选择因子(k),评价MIM对不同抗生素的吸附能力差别;通过公式(4)计算相对选择因子k′,用以显示MIM和NIM对同一抗生素的吸附差别[27]。

Kd=(C0-Ce)×V/(Ce×A)=Qe/Ce

(2)

(3)

(4)

1.6 样品的简单前处理及萃取

取市售牛奶5 g,加入10 mL乙腈混合,随后加入2 g氯化钠,涡旋振荡5 min,在4 ℃下以8 000 r/min 离心10 min,取上清液,作为供试溶液。

取上述50 μL供试溶液滴加在一张MIM上,静置20 min,然后,用200 μL去离子水清洗膜表面,去除非特异性吸附干扰物,最后用1 mL甲醇-冰乙酸(9∶1, v/v)超声洗脱,重复3次,收集洗脱液并用N2吹干,1 mL初始流动相复溶,过0. 22 μm微孔滤膜后待HPLC-MS/MS分析。

2 结果与讨论

2.1 MIM的傅里叶红外光谱表征

对空白PVDF膜、MIM和NIM进行傅里叶红外光谱(FT-IR)测定,结果见图2。NIM和MIM的FT-IR谱图中均存在 1 733 (1 719) cm-1附近的羰基(-C=O)伸缩振动峰和 2 982(2 981) cm-1处羧基的伸缩振动峰。一般来说,1 733 cm-1处的红外吸收为-C=O的振动吸收峰。然而,在MIM的FT-IR谱图中,这个波段被红移到了 1 719 cm-1,这是由于MIM中存在的模板分子恩诺沙星使得功能单体MAA中的-C=O与恩诺沙星中的质子给体C-H或O-H形成氢键,导致MAA中的-C=O减弱,吸收峰红移。并且,空白PVDF的FT-IR谱图在 1 719(1 733) cm-1和 2 981(2 982) cm-1上未见明显吸收,说明有分子印迹层交联在MIM和NIM膜表面。此外,在MIM上存在的 1 636 cm-1处4-吡啶酮的羰基伸缩振动峰,进一步证实了在MIM膜表面成功交联上恩诺沙星分子印迹层。

图 2 (a)空白PVDF膜、(b)MIM和(c)NIM的红外光谱图Fig. 2 FT-IR images of (a) blank polyvinylidene fluoride(PVDF) membrane, (b) molecularly imprinted membrane (MIM) and (c) non-molecularly imprinted membrane (NIM)

图 3 MIM和NIM对不同初始浓度的环丙沙星的平衡吸附容量Fig. 3 Equilibrium adsorption capacity of MIM and NIM for ciprofloxacin under different concentrations

2.2 MIM吸附试验

2.2.1 吸附容量考察结果

MIM和NIM吸附不同浓度的环丙沙星的静态吸附试验结果如图3所示,随着溶液初始浓度的增加,MIM和NIM的吸附量都逐渐增加,在溶液初始浓度大于200 μg/L 后吸附量趋于饱和。MIM达到饱和吸附时的吸附容量为600.01 ng/cm2, NIM在达到饱和吸附时的吸附容量为235.18 ng/cm2,可以看到MIM的吸附量远远大于NIM的吸附量,这是由于MIM上存在特异性孔穴,可以实现对环丙沙星的特异性吸附。

另一方面我们着重培养幼儿的听记能力。在幼儿园日常活动中，我们有意识地借助现代教学媒体播放声音文件，让幼儿进行故事内容听记。为了让幼儿能够准确记住声音信息，我们引导幼儿把机械听记转变成有意听记，也就是让幼儿边听声音边看多媒体展示的图像或视频，或者让幼儿边听边按照声音内容做出相应的动作，或者让幼儿把听到的声音和看到的图像概括性记忆，或者让幼儿用绘画等方式把听到的声音信息表现出来。总之，通过不同的形式，把原本抽象的声音转换成较为具体的动作、画面，在这个基础上再变成字词的语言表达，不仅易于幼儿理解，同时也强化了幼儿的语言记忆能力，提高听记能力。

2.2.2 选择性吸附试验

MIM及NIM对200 μg/L 环丙沙星及其结构类似物氧氟沙星以及竞争物头孢羟氨苄、磺胺嘧啶、阿奇霉素200 μg/L 混合抗生素溶液的吸附结果见表2。其中,Qe和Kd代表了MIM和NIM的吸附能力和吸附效率,可以看到,MIM对CIP的吸附量远远大于NIM,但对于其他竞争性抗生素来说,MIM和NIM的吸附量没有明显区别,而且MIM对CIP的吸附量远远大于MIM对OFL、CFR、SDZ、AZI等其他抗生素的吸附量,说明MIM对CIP的吸附能力和吸附效率较好,这主要是由于MIM表面交联的分子印迹聚合物涂层具有与CIP结构互补的空腔,可实现对CIP的特异性吸附。另外,选择因子k是评价MIM对CIP与相关抗生素特异选择性的一个指标。可以看到,MIM对CIP的吸附效率为OFL的2.19倍,是CFR的1.94倍,SDZ的19.84倍,AZI的30.03倍。这表明,与其他竞争抗生素相比,MIM对CIP有更高的亲和力。此外,相对选择性系数k′可以用来评价MIM和NIM对同种抗生素的选择性差异,通过结果看到,CIP的k′值为3.06,而其他竞争抗生素的k′值约为1,进一步证实了MIM对CIP的特异吸附性能。总而言之,上述所有参数(Qe、Kd、k、k′)都在一定程度上说明:通过分子印迹作用,在PVDF膜表面形成了具有特定形状和大小的印迹孔穴和特异性结合位点,表现出对CIP独特的选择性吸附能力。

表 2 MIM和NIM对不同抗生素的竞争性吸附试验结果(n=3)Table 2 Competitive adsorption test results for MIM and NIM on different antibiotics (n=3)

*Qe=(C0-Ce)×V/A;Kd=(C0-Ce)×V/(Ce×A)=Qe/Ce;k=Kd(CIP)/Kd(others);k′=kMIM/kNIM.Qe: equilibrium adsorption capacity;C0: initial concentration;Ce: equilibrium concentration;V: volume of the initial solution;A: area of MIM & NIM.

2.3 MIM萃取条件优化

以100 μg/L 的环丙沙星加标牛奶样品的回收率为指标,考察MIM萃取时样品溶液的样品量、清洗剂种类、洗脱剂的种类及用量等参数。

2.3.1 样品量

考察了25、50、75、100、125 μL样品量对吸附量的影响,平行做3份,以1.6节的萃取步骤检测平均回收率。结果如图4a所示,当样品量小于50 μL时,环丙沙星的回收率随着样品量的增加而增加,但当样品量大于50 μL时,环丙沙星的回收率随着样品量的增加而降低,这可能是由于当样品量小于50 μL时,MIM吸附未达到饱和,而当样品量大于50 μL时,样品基质过多,有限的清洗剂不足以洗掉共提物,可能会占据一些环丙沙星的位点,导致环丙沙星的吸附量反而减少。因此,样品量确定为50 μL,在达到最大的环丙沙星吸附量的同时,基质的干扰作用最小。

2.3.2 清洗剂的种类

清洗剂的作用是洗去MIM的非特异性吸附物质,清洗剂的种类取决于杂质的种类以及膜对目标物的吸附强度。按照1.6节的萃取步骤,考察了超纯水、乙腈、丙酮、甲醇4种不同的清洗溶剂,结果如图4b所示,使用超纯水作为清洗剂,可以得到最高的回收率(>95% ),以丙酮为清洗剂时,回收率最低,仅为22% 。使用甲醇和乙腈作清洗剂时,回收率也下降到33%左右。因此,我们选用超纯水作为清洗剂,既能有效洗脱掉杂质,又不影响MIM对环丙沙星的吸附能力。

2.3.3 洗脱剂的种类

洗脱剂的作用是洗去MIM上特异性吸附的环丙沙星,破坏环丙沙星与分子印迹聚合物形成的氢键。考察了乙醇-乙酸(9∶1, v/v)、甲醇-乙酸(9∶1, v/v)、丙酮-乙酸(9∶1, v/v)、乙腈-乙酸(9∶1, v/v)对回收率的影响,结果(见图4c)表明,用甲醇-乙酸(9∶1, v/v)作洗脱液时,环丙沙星的回收率可以达到97%左右;使用乙醇-乙酸(9∶1, v/v)作洗脱剂时,回收率最低,仅有14.7% ;使用丙酮-乙酸(9∶1, v/v)和乙腈-乙酸(9∶1, v/v)作洗脱剂时,由于洗脱强度过大,可能会把一些其他干扰物及杂质同时洗脱下来,导致总离子流质谱图峰形变化,回收率不可靠,大于120% 。因此,我们选用甲醇-乙酸(9∶1, v/v)作洗脱剂,回收率稳定可靠。

2.3.4 洗脱剂的用量

洗脱剂的用量决定了是否能把吸附在MIM上的环丙沙星完全洗脱掉,直接影响回收率。在上述优化条件下,以甲醇-乙酸(9∶1, v/v)作为洗脱液,考察了不同用量(1、2、3、4、5 mL)对回收率的影响,结果如图4d所示,当洗脱剂用量较少(1 mL、2 mL)时,回收率较低,分别为43.2%和55.2% ,当洗脱剂用量大于等于3 mL时,回收率较高,大于92% ,表明环丙沙星已基本从MIM上洗脱下来。因此,我们选择3 mL甲醇-乙酸(9∶1, v/v)作为最优洗脱条件。

图 4 不同萃取条件对环丙沙星洗脱回收率的影响(n=3)Fig. 4 Effect of different extraction conditions of on elution recovery of ciprofloxacin (n=3)a. loading volume; b. washing agents; c. eluent; d. eluent dosage.

2.4 方法学考察

2.4.1 标准曲线、检出限与定量限(LOQ)

按照1.3节所述步骤配制环丙沙星标准溶液,按照1.2节方法检测,得到以环丙沙星峰面积(A)对其质量浓度(C)的线性回归方程A=1.58×105C+6 859.21(r2=0.999 6),并做峰面积与质量浓度的回归标准残差分析图,具体标准残差在-2～2之间分布,证明在0.1～200 μg/L 内线性良好。采用稀释法,以3倍和10倍信噪比确定方法的LOD和LOQ,得到环丙沙星的LOD和LOQ分别为0.02 μg/L 和0.1 μg/L。

2.4.2 准确度

准确度通过加标回收率试验来考察。在空白牛奶基质中添加不同水平的环丙沙星(10、50、100 ng/g),每个浓度水平平行测定3次,按照上述1.6节步骤处理后,进行HPLC-MS/MS检测,代入标准曲线方程计算环丙沙星的浓度,并与实际加入量比较,求得各浓度水平下的回收率。结果如表3所示,加标回收率在92.6% ～119.1%之间,表明准确度良好。

2.4.3 精密度

制备含不同量环丙沙星(10、50、100 ng/g)的空白牛奶样品,每个水平做5个平行样品,按照上述1.6节步骤处理后,洗脱液进行HPLC-MS/MS检测,连续测定3天,计算得到日内精密度和日间精密度。结果如表3所示,可以看到日内精密度在4.8% ～7.9%之间,日间精密度在3.3% ～7.7%之间,表明精密度良好。

表 3 CIP在牛奶样品中3种不同加标浓度下的回收率及其RSDTable 3 Recovery and RSDs of CIP spiked in milk sample at three spiked levels

2.5 实际样品测定

从当地超市收集了4种不同品牌的牛奶样品并进行了分析,在这些牛奶样品中均未检测到CIP残留。

3 结论

本研究制备了一种恩诺沙星分子印迹膜,该MIM对环丙沙星显示出良好的选择性及较高的吸附能力,因此可将其用于牛奶样品中环丙沙星的提取和富集。实验结合高效液相色谱-串联质谱实现了食品基质中痕量环丙沙星的快速检测,前处理简单,准确度及精密度良好。可以推测，通过制备特定种类的不同分子印迹膜，能够实现食品中不同非法添加物的检测，为食品安全监管检测提供新的思路。