孕妇外周血分离胎儿有核红细胞与FISH分析技术在无创性产前诊断中的应用分析

王 伟，张 红，袁琼英

（1.黄冈职业技术学院，湖北 黄冈 438002；2.黄冈市妇幼保健院，湖北 黄冈 438000）

想要成功由孕妇外周血内分选胎儿有核红细胞，几乎无可避免发生母体细胞受污染问题，所以需要对此准确鉴定。临床中目前应用于胎源性有核红细胞鉴定主要包括以下几种方法[1]：形态学染色、PCR(聚合酶链式反应)对SRY基因扩增、STR（短串联重复序列）的扩增、FISH（荧光原位杂交）等。所以在临床中通过运用胎儿有核细胞等特点，实现无创性产前诊断意义重大且十分可行。在孕妇外周血中富集、纯化胎儿有核红细胞，作为非侵入性操作，且运用于临床有着安全可靠无损伤母婴的技术特点[2]。因此本研究探讨分析孕妇外周血分离胎儿有核红细胞与 FISH分析技术在无创性产前诊断中的应用。现报道如下：

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取于2018年1月至2019年1月期间，我院收治的20例11～24周妊娠高危孕妇展开研究。所有产妇孕周均为 11～24周，年龄均为 21～37岁，平均年龄为（28.7±3.5）岁。纳入标准：（1）所有产妇均未存在严重贫血情况，阳性对照其中有4例足月分娩时脐带血，阴性对照均属于并未存在孕产史的健康女性。（2）对本次研究知情同意配合研究。排除标准；（1）严重心、肝、肾系统疾病者；（2）合并糖尿病、妊娠并发症以及剖宫产等病症。

1.2 方法

（1）密度梯度离心。对所有纳入本次的孕妇均抽取15ml肘部静脉血和1ml脐血，以常规方式进行分离并取单个核细胞。

（2）FACS分选。通过运用PBS洗涤分离得出的单个核细胞重复2次，之后根据1×106个细胞，加入至单克隆抗体CD71-PE（转铁蛋白受体1）内 10ul，完成 0.5h常规室内孵育之后，进行PBS（磷酸缓冲盐溶液）冲洗后将固定、破膜剂加入其中做固定破膜处理，并且根据以上细胞比例将HbF-FITC（(HbF)的偶联于FITC的单克隆抗体）单克隆抗体加入其中，进行20min常温室内孵育后PBS 冲洗，实现上机分选并同类型对照将非特异性排除，运用流式细胞仪设备设定了FSC、SSC和对应的荧光强度相关参数，最终分选得出CD71、HbF双阳性细胞。

（3）FISH 通过将抽取分离所得的细胞作充分洗涤处理之后，运用0.075mol/L低渗30min，甲醇冰乙酸按照3:1比例，固定支座细胞混悬液滴片备用，并运用蛋白酶K硝化液硝化处理滴片3min，运用2×SSC进行2min洗涤处理，逐次运用75%、85%、100%不同浓度乙醇进行2min脱水处理，之后将探针13、18、21加入其中，X、Y使用盖玻片盖封，在78℃下进行3min变性处理，运用湿盒进行避光37℃过夜待用。将盖玻片去除之后置入72℃下，运用含有0.3%浓度NP40的0.4×SSC、0.1%浓度的NP40的2×SSC，进行2min洗脱处理以及40s的DAPI重复染色，之后封片并于显微镜设备下，对荧光图像处理系统仔细观察分析。分娩后随访婴幼儿。

2 结果

2.1 单密度梯度离心之后细胞涂片检查

对20例孕妇的血样本进行处理检查，并未发现NRBCs，NRBCs的体积较大且细胞核浓染，细胞浆以紫红色为主，NRBCs对比母亲机体的有核红细胞数量，结果为1：105～107。阳性对照组存在大量NRBCs。

2.2 孕妇外周血中HbF、CD71细胞含量

20例所有孕妇的外周血标本NRBC分选，达100%的分选率。CD71以及HbF双阳性细胞含量情况如下，20例高危孕妇的CD71及HbF双阳性细胞含量是（3.46±1.65）×10-2，足月儿脐血为（30.46±21.39）×10-2，健康女性为（0.08±0.06）×10-2，经过对其中18例孕妇运用FISH分析技术均成功分析，且并未发现存在任何异常问题（见表 1）。

表1 孕妇外周血中HbF、CD71细胞含量

2.3 孕妇外周血中胎儿有核红细胞FISH结果

在5例分娩男胎的孕妇机体外周血标本中，发现运用Y探针信号，3例女胎在母体外周血标本内，除了X探针信号并未见Y探针信号。但是在后期胎儿的分娩过程中进行随访，发现4号标本经FISH误诊是女胎，实为男胎。运用 18、21探针进行FISH诊断时，并未发现探针信号细胞，且随访婴幼儿分娩结局也并未发现先天遗传疾病。

3 讨论

在临床于1983年便有学者对孕妇外周血内胎儿细胞分离富集问题展开研究，经研究发现孕妇死于子痫疾病机体循环，发现滋养层细胞的存在，经临床深入研究这一观点逐渐演变并得以证实[3]。在目前临床统一划分了孕妇外周血内的胎儿细胞种类，包括四类分别为滋养层细胞、有核红细胞、淋巴细胞以及粒细胞[4]。其中胎儿有核红细胞由于本身拥有十分完整的基因组DNA，所以被广泛运用于临床胎儿遗传类疾病分析中，并且生存周期较短细胞数量较多，不受上次妊娠干扰。不仅如此有核红细胞还具备了稳定的细胞表面抗原特性，可以将CD71类膜受体分离，所以目前在临床被统一证实，可以运用于孕妇产前无创伤诊断的关键靶细胞[5]。

临床运用于胎儿细胞分离富集有诸多方法，本次研究中通过运用流式细胞分析仪，经近年临床研究结果统一发现运用 FACS方法，可以作为较普遍的细胞自动化分选技术[6]。巩固运用中快速测量体内分散悬浮细胞生物化学及物理特定参数，并且以原本设定的参数范围为依据，划分测量的细胞亚群。以往研究中Bianchi表示,FACS是最佳分选富集胎儿细胞的关键技术[7]。FACS具备了达到较高细胞富集纯度的优势特点，并且运用该技术能够实现胎儿细胞富集高达1000倍。本次研究结果也证实通过20例所有孕妇的外周血标本NRBC分选，达100%的分选率。20例高危孕妇的CD71及HbF双阳性细胞含量是（3.46±1.65）×10-2，足月儿脐血为（30.46±21.39）×10-2，健康女性为（0.08±0.06）×10-2。

如今临床广泛运用的胎儿细胞分离抗原标记主要包括了阳性、阴性两类选择。在阳性选择中又以γ珠蛋白、CD71等选择为主，在阴性选择中则主要运用CD45转铁蛋白受体。该受体作为临床中胎儿红细胞膜抗原组织，可以达到随着孕妇的孕周逐渐增加细胞高表达也愈明显的特性，更会随着胎儿红细胞逐渐成熟，此种抗原组织也会逐渐不见，因此对于临床分离胎儿细胞尤为适合[8]。γ珠蛋白一般在胎儿血红蛋白细胞中存在，在孕妇孕周 6周左右出现γ珠蛋白，尽管妊娠会对孕妇机体产生刺激作用，合成少量的 HbF，但是胎儿含有的NRBCs含量要明显高于HbF含量。以往研究中表示γ珠蛋白 83%～100%的细胞均为NRBCs，可以达到 45%的细胞分离纯度。本次研究结果通过以CD71、HbF双阳性细胞，进行胎儿细胞标记和流式细胞仪分选，能够进一步提高获得胎儿有核红细胞的FISH分析数量及纯度[9]。

FISH技术在临床作为对母血内胎儿细胞重要细胞遗传学方法之一，能够直接检测有关异常染色体的细胞，在临床以往研究结果中表明，运用FISH技术能够成功实现18三体、21三体胎儿的无创诊断。本次研究结果也证实在5例分娩男胎的孕妇机体外周血标本中，发现运用Y探针信号，3例女胎在母体外周血标本内，除了X探针信号并未见Y探针信号。但是在后期胎儿的分娩过程中进行随访，发现4号标本经FISH误诊是女胎，实为男胎。运用18、21探针进行FISH诊断时，并未发现探针信号细胞，且随访婴幼儿分娩结局也并未发现先天遗传疾病。