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荧光标记哌嗪抗菌聚合物的制备及生物学评价

2020-05-22孙竹兴邓奎林刘娜张欢雨刘红梅

关键词:香豆素氨基抗菌

孙竹兴,邓奎林,刘娜,张欢雨,刘红梅

(河北大学 化学与环境科学学院 药物化学与分子诊断教育部重点实验室,河北 保定 071002)

细菌无处不在,感染可导致人类大部分的疾病和所有的传染病.使用抗菌剂是防治细菌滋生和繁殖的有效手段.相对于小分子抗菌剂而言,高分子抗菌材料具有更强、更持久、更稳定的抗菌性能,更低的毒性和环境友好[1-3].近年来高分子抗菌材料的制备以及在临床上的应用引起了学者广泛关注.新型抗菌聚合物通过对物质结构的分析将具有抗菌作用的单体或官能团通过各种反应,制备出主链或支链具有抗菌官能团的新型聚合物[4].Sun等[5]提出了一种基于立体化学策略的冰片修饰的聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)得到P(MMA-co-BA)的抗菌共聚物,不少于10%的冰片丙烯酸酯(BA)片段可对大肠杆菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢杆菌(Staphylococcusaureus)产生独特的抗菌活性,高达25%的BA片段可赋予该共聚物出色的抗菌性能.哌嗪对临床上一些耐药性菌株也非常有效,而且可以增加聚合物溶解性,改善其生物活性.Zhang等[6]通过乙二胺四乙酸二酐(EDTAD)和哌嗪(PA)的缩聚反应得到一种抗菌哌嗪衍生物(PE-B),抗菌测试结果表明,PE-B对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均表现出有效的抑制活性.Hassan等[7]通过2-硝基苄基氯和哌嗪反应合成二胺2,20-(哌嗪-1,4-二基双(亚甲基))二苯胺,抗菌研究结果表明,该化合物对苏云金芽孢杆菌、腐生葡萄球菌和果胶杆菌均表现出比妥布霉素和四环素更高的活性[7].但抗菌材料的研究不应止于此,笔者期待有更大、更广阔的发展.

荧光分析与成像技术具有灵敏度高、分辨率高、选择性好、可实时监测、对生命体损伤小等优势,在生物化学、医疗诊断等方面得到了广泛的研究和应用,并可用来观察其他技术无法观察到的组织形态细节[8].荧光标记物具有标记简便、响应时间快等优点[9-10],已经成为探究细胞微观结构的重要手段.因此,在抗菌性聚合物等生物材料的活细胞成像研究中,荧光分析与成像是不可或缺的.香豆素类荧光化合物具有发射强度高、色光鲜艳、荧光强烈等优点,能较好地标记于活细胞,成为荧光分析与成像研究中重要的荧光分子之一[11].在材料结构上引入了香豆素类荧光基团,使其具有标记、监测和示踪的能力[12-13].笔者通过简便高效、原子经济的Ugi反应一锅法合成了含有香豆素和哌嗪独特结构的新型荧光标记抗菌聚合物——聚(1,4双-(3氨丙基)呱嗪/PB/醛/叔丁基异腈)(PC)[14].评价了PC的抗菌性能,并利用其活细胞标记和示踪的能力,研究了其在细菌抑制及活细胞成像上的性能.这种既具有优异生物相容性,又具备良好抗菌性以及荧光标记能力的新型生物材料,在生物医学领域具有潜在的应用价值[15].

1 材料与方法

1.1 仪器和试剂

津岛RF-5301PC荧光分光光度计(日本),津岛UV-3600型紫外可见分光光度计(日本),Bruker AVANCEⅢ 600-MHz NMR波谱仪(瑞士),ZEISS LSM 880激光扫描共聚焦显微镜(德国),Bioscreen C多功能微生物生长自动培养(芬兰).苯甲醛,1,4双(-3-氨丙基)哌嗪,叔丁基异腈,相对分子质量为800的聚乙二醇,4-(二乙氨基)水杨醛,DMEM培养基,胰蛋白酶,胎牛血清,ATT,所用化学品及试剂均为分析纯.

1.2 聚合物的合成

1.2.1 单体聚乙二醇二丁二酸酯(PB)的合成

将相对分子质量为800的聚乙二醇(1.600 g,2 mmol)、丁二酸酐(5.000 g,5 mmol)加入到反应瓶中,80 ℃下搅拌反应48 h.用乙酸乙酯溶解产物并在乙醚中沉淀3次,在40 ℃下真空干燥12 h 得到白色固体,合成路线如图1所示.

图1 PB单体的合成Fig.1 Synthesis of PB monomer

1.2.2 单体7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素的合成

1)7-N,N-二乙氨基香豆素的合成:将4-(二乙氨基)水杨醛(1.93 g,10 mmol)溶于40.0 mL乙醇中,加入丙二酸二乙酯(3.12 mL,20 mmol)和哌啶(1 mL,10 mmol).搅拌反应混合物并加热回流过夜,通过TLC监测反应.减压除去溶剂,然后加入浓HCl(20.0 mL)和冰醋酸(20.0 mL)进行水解并再搅拌6 h,将溶液冷却并倒入100 mL冰水中.加入质量分数40%NaOH溶液以将溶液的pH值调节至7,向溶液中加入30.0 mL二氯甲烷,用水(3×10.0 mL)洗涤有机层,用MgSO4干燥,然后真空浓缩,通过柱色谱法用乙酸乙酯-己烷(体积比1∶3)纯化粗产物.得化合物1.

2)7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素的合成:在50 ℃下,将干燥的DMF(2.14 mL,27.79 mmol)在N2气氛下滴加到POCl3(2.18 mL,23.16 mmol)中并搅拌30 min,得到红色溶液.将化合物1(2.01 g,9.26 mmol,溶于10.0 mL DMF)滴加到该溶液中.将混合物在70 ℃下搅拌12 h,然后倒入100 mL冰水中.加入质量分数20%NaOH溶液以将混合物的pH值调节至7.将粗产物用30.0 mL乙酸乙酯稀释,有机层用水(3×10.0 mL)洗涤,用MgSO4干燥,然后真空浓缩.通过柱色谱法用乙酸乙酯-己烷(体积比1∶2)纯化粗产物,得化合物2.合成路线如图2所示.

1.7-N,N-二乙氨基香豆素;2.7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素.图2 7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素的合成Fig.2 Synthesis of 7-N,N-Diethylamino-3-aldehyde counarin

1.2.3 聚合物PC的合成

将苯甲醛(0.388 g,3.6 mmol),1,4双-(3-氨丙基)哌嗪(0.416 g,2 mmol),7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素(0.098 g,0.4 mmol)依次加入反应瓶中,再加入4 mL甲醇.室温下搅拌反应0.5 h,然后加入PB(1.634 g,1 mmol)反应0.5 h,再加入叔丁基异腈(0.338 g,4 mmol),继续反应2 d后.将产物用截留相对分子质量 1 000 u的透析袋透析48 h,每隔3 h换1次水,冷冻干燥,得白色粉末,即为目标产物PC.合成路线如图3所示.

图3 聚合物PC的合成Fig.3 Synthesis of polymer PC

1.3 细菌培养

将冻存的E.coli和S.aureus在斜面上复苏,然后传代;取10 mL LB液体培养基于25 mL锥形瓶中,高温高压灭菌后,置于超净台上自然冷却.用接种针挑取1环加入到液体培养基中,37 ℃培养16~18 h,备用.

1.3.1 滤纸片法

将质地均匀的滤纸片用打孔器制成10 mm的滤纸片,灭菌、干燥;以50 mg/mL PC作为样本,以相同浓度氨苄青霉素溶液作为阳性对照,生理盐水作为阴性对照.将样品滤纸片和阴阳对照分别置于LB固体培养基制成的平板中,间距25 mm,在37 ℃环境中培养24 h,观察抑菌圈大小.

1.3.2 细菌生长曲线法

取生长良好的E.coli和S.aureus用LB培养基调节OD600为0.1的菌悬液;然后将50 mL LB培养液与1 mL菌悬液混合,加入到蜂窝板上,加入PC使其终质量浓度分别为0、1、5、10、20、50 mg/mL,每个样设置3个平行(结果取3个数的平均数),每隔1 h测1次,测72 h.

1.4 细胞培养

实验所用细胞为Hela细胞,采购于北京协和细胞资源中心,培养条件为含体积分数10%胎牛血清的高糖DMEM培养液,培养环境为37 ℃,体积分数5%CO2的细胞培养箱.48 h换1次培养液,当细胞密度达到对数生长期时,用胰酶消化传代.

2 结果与分析

2.1 聚合物的结构表征

采用核磁共振氢谱、红外光谱等手段对聚合物进行了结构表征.图4是PC的红外谱图.3 193 cm-1处的特征峰为酰胺中N—H的伸缩振动峰,酰胺键中C=O伸缩振动峰出现在1 678 cm-1处;酯键上C=O伸缩振动峰出现在1 733 cm-1处,饱和C—H的特征峰在2 871 cm-1处.

图5为PC在氘代氯仿中的1H NMR核磁谱图.化学位移δ=1.13处为7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素中的(-CH3,a)上的质子峰,δ=1.30处为叔丁基中(CH3-,b)上的质子峰,1.40~1.75处的化学位移归因于1,4-双(3-氨丙基)哌嗪中(-CH2-,c、d)上的质子峰,化学位移δ=3.54~3.65处为(-OCH2CH2-,k、j)上的质子峰,苯甲醛上(-CH-,r、s)的吸收峰在δ=7.20~7.35处,7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素中(-CH-,t)的吸收峰在7.70处.由FTIR与1H NMR分析表明所得产物为目标聚合物,并通过GPC测得PC的摩尔质量为2.76×104g/mol.

图4 PC的红外光谱Fig.4 FTIR spectrum of PC

图5 PC的1H NMR核磁谱Fig.5 The 1H NMR spectrum of PC

2.2 抑菌性研究

2.2.1 滤纸片法测定抑菌性能

为表征PC的抑菌性能,进行了滤纸片实验,PC质量浓度为50 mg/mL,阳性对照为相同质量浓度的氨苄青霉素溶液,阴性对照为生理盐水.使用E.coli和S.aureus2种细菌,实验结果如图6所示,PC在2种菌落上均出现明显的抑菌圈,说明PC对2种细菌的生长均有抑制作用.

图6 PC对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑制性能Fig.6 Inhibitory properties of PC against E.coli and S.aureus

2.2.2 生长曲线法测定抑菌作用

为了进一步验证聚合物的抑菌性,利用细菌的生长曲线来检测PC的抑菌性能,选择了0、1、5、10、20、50 mg/mL 6个不同质量浓度的PC溶液,分别加入到大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的孔板中,培养72 h后绘制2种细菌的生长曲线,如图7和图8所示.

图7 不同质量浓度PC下E.coli的生长曲线Fig.7 Growth curve of E.coli under different concentrations of PC

图8 不同质量浓度PC下S.aureus的生长曲线Fig.8 Growth curve of S.aureus under different concentrations of PC

2.3 聚合物的荧光性质测定

为了研究探针的紫外可见吸收和荧光性质,对其光谱性能进行测定.将聚合物PC配成质量浓度为1×10-2μg/mL的溶液进行光谱测定,结果如图9所示,PC的紫外最大吸收波长λmax为405 nm,最大激发波长λex为420 nm,最大发射波长λem为492 nm.

图9 PC的紫外吸收谱(a)和荧光光谱(b)Fig.9 UV absorption spectrum of PC(a) and fluorescence spectrum(b)

2.4 细胞相容性研究

2.4.1 MTT法结果分析

生物相容性是抑菌材料应用于各领域的一个重要参数,笔者研究了不同质量浓度和时间下PC对Hela细胞生长的影响,并计算存活率,结果如图10所示,只有在质量浓度为50 μg/mL,72 h时,细胞最低生存率为86.95%,其他存活率均大于87.15%,可初步证明PC几乎不对细胞产生毒性.

2.4.2 AM-PI双染色法

为更进一步验证PC的低细胞毒性,将PC(50 μg/mL)与细胞共培育24 h和72 h后,用5 μg/mL的钙黄绿素AM和5 μg/mL碘化丙啶PI进行染色,孵育细胞30 min后PBS洗3次,共聚焦显微(20×),染料AM的激发波长488 nm,接收波长500~580 nm;染料PI的激发波长561 nm,接收波长580~680 nm.结果如图11所示,可以看出,镜下细胞绝大部分均显示为活细胞,可知PC的细胞毒性较小,不影响细胞正常生命活动.

图10 不同质量浓度和时间下PC的细胞毒性Fig.10 Cytotoxicity of PC at different concentrations and times

比例尺:20 μm.图11 24 h空白对照组明场(a)和AM-PI双染色(b),72 h空白对照组明场(c)和AM-PI双染色(d)Fig.11 24 h blank control group bright field (a) and AM-PI double staining (b),72 h blank control group bright field map (c) and AM-PI double staining stain (d)

2.5 活细胞成像研究

2.5.1 PC在活细胞内成像

为了研究PC质量浓度与荧光强度的关系,利用激光扫描共聚焦显微镜进行成像.细胞用质量浓度为0,10,20,50 μg/mL的PC培养液孵育1 h后,用PBS洗涤3次,共聚焦显微镜成像(40×),405 nm激发,接收波长为410~515 nm.结果如图12所示,由图12可知,探针在细胞内发出较明显的荧光,且随着探针浓度增大,荧光强度逐渐增强.

比例尺:20 μm.图12 活细胞内聚合物PC的荧光强度Fig.12 Fluorescence intensity of polymer PC in living cells

2.5.2 活细胞内PC的荧光稳定性

为研究PC在细胞内的荧光稳定性,将PC(50 μg/mL)与细胞共培养1 h后PBS洗3次,共聚焦显微镜成像(63×oil),成像方式为持续扫描15 min,如图13所示.由图13可知,探针荧光强度衰减较弱,依然具有较为强烈的荧光.图14为细胞内荧光衰减曲线,荧光强度在15 min内从139降至122,证明PC在细胞内具有良好的荧光稳定性.

比例尺:5 μm.图13 PC在活细胞内的荧光稳定性Fig.13 Fluorescence stability of PC in living cells

图14 PC的荧光衰减曲线Fig.14 PC fluorescence decay curve

2.5.3 光漂白恢复

为了探究PC的分子流动性,将PC(50 μg/mL)与细胞共培养1 h后,用PBS洗3次,共聚焦显微镜成像(63×oil).如图15所示.对活细胞区域1进行光漂白,并观察其荧光恢复情况,使用fit formula拟合公式进行分析,得到光漂白恢复曲线,如图16.证明在经过光漂白后,PC在活细胞内荧光强度下降,但在较短时间(以平均每分钟荧光强度恢复22.89的速度),其荧光强度显著恢复,证明聚合物PC的分子在活细胞内具有良好的流动性.

区域1为光漂白区域,区域2为荧光对照区域,区域3为背景区域,比例尺:5 μm.图15 不同区域的光漂白图像Fig.15 Bleaching image of different areas area

图16 不同区域荧光强度变化曲线Fig.16 Fluorescence intensity curve of different regions

2.5.4 PC在活细胞内长时程成像

良好的生物相容性及光稳定性是评价探针应用的重要因素,为了进一步探究PC对细胞生长过程的影响,用PC(50 μg/mL)对Hela细胞进行染色,利用激光共聚焦(40×)及活细胞工作站进行20 h的在线长时程观测.结果如图17所示.从长时程成像中可以看到加入PC后,细胞的生命活动没有受到明显的影响,可以进行正常的分裂和生长,因此可以看出PC对Hela细胞的毒性较小,不影响其正常的生命活动,并且从中可以看出,在20 h内,可持续观测到荧光,但由于时间较长焦平面丢失,只有在细胞分裂时可看到明亮的荧光,未分裂细胞的荧光较为模糊.

比例尺:10 μm.图17 PC在活细胞内的长时程成像Fig.17 Long-term imaging of PC in living cells

3 结论

以1,4双-(3-氨丙基)哌嗪、7-N,N-二乙氨基-3-醛基香豆素、PB、叔丁基异腈、苯甲醛为原料,通过高效、原子经济性的Ugi反应得到了新型荧光标记哌嗪抗菌聚合物PC.通过抑菌性研究表明PC对E.coli和S.aureus的生长有明显的抑制作用,且对E.coli的抑制作用更明显,可能与细胞壁结构有关;MTT法及AM-PI双染色法表明PC生物相容性好;通过一系列活细胞成像研究,表明了PC具有良好的荧光性能、良好的荧光稳定性、良好的分子流动性等特点,可作为性能优异的荧光标记物.作为新型的抗菌材料,PC不仅可广泛用于细胞、细菌方面的研究,还可应用于活体内细菌的指示剂,为未来抗菌材料的研发提供了一种新思路.

致谢:感谢河北大学硕士研究生贾旭、王游游和付聪聪同学在实验中给予的帮助.

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