不同外科手术取精时机对卵胞浆内单精子注射临床结局的影响

潘承双，张欢，徐芝慧，金建远，费前进，倪吴花

（温州医科大学附属第一医院生殖医学中心，浙江温州325015）

随着人类辅助生殖技术不断创新和进步，特别是单精子卵胞浆内注射术（intracytoplasmicsperminjection，ICSI）用于治疗男性不育，配合外科附睾和睾丸取精术，使大部分既往需要通过供精或领养才有孩子的无精子症男性不育患者有了成为生物学父亲的机会。精子因素会对辅助生殖技术治疗的结果产生负面影响。精子在通过男性生殖道时易受损伤[1]，一些研究表明，与男性因素不育症患者（包括隐匿精子症、畸形精子症、重度少精子症或严重弱精子症患者）中的射精精子相比，使用睾丸精子具有更高的着床率、妊娠率和活产率[2-3]。对于精子DNA高损伤的试管婴儿反复失败患者，推荐使用睾丸精子而不是射精精子进行ICSI[4-5]，即使精液常规参数正常[6]。

外科手术取精依据部位可有附睾取精或睾丸取精。通常取精安排在取卵当天进行，如果找不到精子，可行供精治疗。但当天睾丸活检一般获得的可注射的活动精子较少，收集足够注射用的精子可能需要几个小时。有研究表明睾丸精子体外培养可促进细胞分化及提高精子活动力，并可获得与射精精子相当的受精率、着床率和妊娠率，建议睾丸活检可以在取卵前一天进行[7]。然而，该类研究涉及例数少，且针对另一种外科取精方式（附睾活检取精），在取卵前一天进行的附睾活检取精的临床应用和体外培养精子用于卵胞浆内单精子注射的临床结局目前尚未见有报道。本研究探讨外科取精（包括睾丸取精与附睾取精）次日行ICSI治疗的可行性，并评价外科手术取精时间对ICSI临床妊娠结局的影响。

1 资料和方法

1.1 一般资料 回顾分析2008年1月到2017年12月在温州医科大学附属第一医院就诊行外科手术取精-ICSI治疗的839例新鲜周期的临床数据。纳入标准：男方因无精子症，不射精，勃起功能障碍等无法手淫获取精液精子或精液精子活动力差采用外科取精-ICSI助孕的患者。所有入选周期排除了女性因素（卵巢储备功能下降、获卵数小于4、严重染色体异常等），以及由于各种原因如：卵巢过度刺激高风险、无胚胎移植、宫腔积液、患者主观因素等未移植新鲜胚胎者。手术的时间是根据试管婴儿实验室预先确定的工作负荷来设定的，目的是在工作负荷较低的日子进行手术，避免周末手术，并适应医师的需要。因此，基于这种随机分配，形成了2组。根据取精时间与授精时间差分成取精当日ICSI组与取精次日ICSI组。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 精液检查：所有患者禁欲2～8d，手淫方法取精。记录禁欲时间，按照WHO精液分析手册行精液常规检查。无精子症患者需反复3次以上检查。无精液症患者行高潮后尿液离心镜检，以鉴别逆行射精。

1.2.2 手术取精：患者取仰卧位，常规消毒、铺巾，0.5%利多卡因行精索阻滞和阴囊皮肤局部浸润麻醉，固定一侧附睾（或睾丸），采用8号针经皮穿刺附睾（或睾丸），由助手用10mL注射器维持负压8～10mL，直至吸取附睾液（或睾丸组织条）。

1.2.3 手术取精后精液处理：将附睾液镜下直接观察，密度梯度离心法制备精子；将睾丸组织放入3mLHTF-HEPES培养液中，将其在培养皿底部的井字划痕上来回搓动，磨碎曲细精管，镜下观察可见精子，组织悬液离心10min后弃上清液，加入0.2mLHTF-HEPES，获得的睾丸组织悬液作10μL长滴。

1.2.4 ICSI授精：卵子经过透明质酸酶（美国Sigma公司）剥除颗粒细胞后，转移培养液滴中行ICSI。受精后16～18h，胚胎转移至培养液中培养，显微镜下观察受精情况，见到双原核和双极体为正常受精。

1.2.5 胚胎质量评估：2 组患者所获得的成熟卵母细胞行ICSI操作，成功受精后体外培养至第3天（D3），结合本中心临床操作实际经验，对胚胎进行评分，选择优质胚胎进行移植。优质胚胎的标准[8]为：正常受精发育而来的胚胎，卵裂球数目7～9个，碎片≤15%，卵裂球无明显大小差异，定义为I级胚胎；可移植胚胎的标准为：卵母细胞正常受精后第3天形成细胞数量≥4个且级别在II级以上的胚胎。其余胚胎继续培养至囊胚期，行冷冻保存。

1.2.6 胚胎移植和妊娠检查：选择评分最高的2～3枚胚胎进行移植，剩余胚胎进行囊胚培养，以移植后4周阴道B超下出现孕囊和胎心为临床妊娠[9]。

1.3 统计学处理方法 采用SPSS19.0软件对数据进行处理。计量资料采用表示，2组比较采用t检验；率的比较采用χ2检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基础情况 共839例外科手术取精。依据临床诊疗指南[10-11]进行患者分类，其中梗阻性无精子症689例（占82.1%），非梗阻性无精子症55例（占6.6%），勃起功能障碍33例（占3.9%），不射精33例（占3.9%），逆行射精9例（占1.1%），重度少精子症13例（占1.5%），重度弱精子症7例（占0.8%）。

2.2 2组一般情况比较 共839新鲜周期ICSI，取精当日ICSI组396例（附睾289例，睾丸107例），取精次日ICSI组443例（附睾307例，睾丸136例）。患者年龄为27～39岁，不育年限（4.0±3.0）年，当日ICSI组与次日ICSI组比较，2 组的不育年限、女性年龄、获卵数、女性BMI、移植胚胎数差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。胚胎体外培养和临床结果显示2组的受精率、成熟率、卵裂率、D3优质胚胎率、种植率、临床妊娠率、流产率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表2。

2.3 2种取精方式临床结局 2种取精方式（附睾、睾丸取精）当日ICSI与次日ICSI受精率、成熟率、卵裂率、D3优质胚胎率、种植率、临床妊娠率、流产率差异均无统计学意义（P＞0.05），见表3-4。

表1 外科取精当日ICSI组和次日ICSI组患者的生理特征

表2 外科取精当日ICSI组和次日ICSI组胚胎体外发育和临床结果（%）

表3 附睾取精当日ICSI组和次日ICSI组胚胎体外发育和临床结果（%）

表4 睾丸取精当日ICSI组和次日ICSI组胚胎体外发育和临床结果（%）

3 讨论

辅助生殖中外科取精ICSI治疗，通常取精安排在取卵当天进行，取精手术可以安全地推进到女方取卵手术前一天[12]。采用这种做法可能会给夫妻双方和医疗团队带来一些实际的好处，其中包括：①实验室工作人员有足够的时间仔细搜寻精子[13]；②更好地规划实验室和手术室的活动；③在压力较小的条件下，夫妇有更多时间考虑使用供精的可能性，同时男性患者在配偶取卵日无需再次手术，可参与配偶取卵后护理。因此提前一天外科手术取精是临床上可行的一种治疗手段，对ICSI治疗有益。

有研究表明，精子体外培养可促进细胞分化及提高精子活动力，因而建议手术取精可以在取卵前一天进行[7]。但也有研究证实精子在体外环境培养时间延长，细胞代谢产生的活性氧可能影响细胞膜流动性和DNA稳定性，精子DNA碎片会增加[14]，进而影响胚胎的发育潜能，从而降低临床妊娠率和增加流产率[1，15]。本研究结果表明，在培养基中过夜培养对精子活力没有不利影响。胚胎移植后，在数量和质量上比较，新鲜精子和过夜培养精子的植入率和临床妊娠率分别为34.4%和35.4%，这与KARACAN等[16]的研究类似。使用新获得的精子与延长培养的精子相比，临床妊娠率在附睾取精组相同，睾丸取精组有5%的差异，提示睾丸精子提前一天获取可能获得较好的临床结果，这可能跟体外培养后睾丸精子活力增强有关[17]，但睾丸组织体外培养的最佳物理和化学方法尚未确定，同时这种差异没有达到统计学意义，这可能与样本量有关。

非梗阻性无精子症患者睾丸存在生精障碍或阻滞，对生精阻滞的精子，延迟体外培养时间，精子成熟度可能趋于好转。ESTEVES等[18]能寻见精子并行ICSI的非梗阻性无精子症精子只能在睾丸极少局灶部位被找到，因此寻找精子的难度明显增加。一旦寻见精子并实现活产，胎龄、出生体质量、围产期死亡率和畸形率似乎不受睾丸生精功能障碍的影响[18]，但对外科取精ICSI的子代安全性还有待更多的人群分析持续监测。显微外科取精可增加精子获取率[19-20]，对未获得精子的非梗阻性无精子症，以供精治疗，非梗阻性无精子症精子获取率不在本研究范围。非梗性无精子症外科可获得精子的临床治疗结局52.7%（29/55），而梗阻性无精子症组临床妊娠率56.0%（386/689），两者差异无统计学意义，本研究结果提示睾丸生精功能障碍并未对ICSI治疗结局有不利影响，但仍需更大样本量证实。

GRECO等[21]研究发现同一患者精液精子中的DNA损伤较睾丸精子明显增加，并认为精子DNA损伤主要由于睾丸后的氧化应激，因此推荐在临床中应优先选择睾丸精子行ICSI受精。另一种观点认为，大多数精子只有到达附睾远端后，在附睾及输精管分泌的特定物质的作用下才得以成熟并获得受精的能力[22]，因此推荐在临床中应优先选择附睾精子行ICSI受精。对外科取精精子行相关检查分析，将更有利于了解外科不同部位获取的精子质量，从而进一步探讨外科取精部位对辅助生殖技术的影响。遗憾的是，我们之前并未对睾丸、附睾精子行精子DNA碎片分析，有待后续进一步研究。但不管是附睾精子还是睾丸精子，当日授精与次日授精在受精率、成熟率、卵裂率、D3优质胚胎率、种植率、临床妊娠率、流产率差异均无统计学意义，外科取精时间并不影响辅助生殖临床结果。

综上所述，无论是采用附睾精子还是睾丸精子，提前一天手术取精并未对ICSI结局有显著影响。但由于本研究样本量小，局限于胚胎早期发育和临床妊娠方面，缺少附睾和睾丸精子DNA碎片分析结果，仍需进一步研究证实。