献血者因素对保存期间红细胞溶血的影响

何博 苏玮 梁雪开 欧阳剑 戚艳萍 黄晓斌

1广州血液中心（广州510095）；2广州市医学重点实验室（血液安全重点实验室）（广州510095）

安全有效地储存红细胞（erythrocyte/red blood cell，RBC）是近一个世纪以来输血治疗的核心［1］。尽管开发出系统的存储解决方案和介质［2］，RBC的存储已取得显著进步，但RBC 的存储病变仍然是血库的主要问题。影响RBC储存病变的因素，包括储存时间，血液成分制造方法和献血者因素［3］。目前多数研究侧重于前两个，对于献血者的个体差异对储存RBC 的影响研究极少。有研究［4］表明，献血者具有遗传多样性，对红细胞储存和输血效果具有潜在影响。虽然这种遗传差异的临床效果尚未确立，但在动物实验已经证明［5］。除遗传背景外，献血者性别已被证明会影响红细胞储存溶血和相关指标［6］。有研究［7］表明，来自男性的红细胞在冷藏保存后表现出应激诱导溶血的易感性增加，睾酮参与此机制。最近一项观察性研究显示女性和年轻献血者增加了输血后死亡风险［8］。为了进一步探究献血者在储存期间溶血易感性方面的差异，本研究纳入献血者因素，性别，年龄和民族对自发的储存溶血的影响。

调节储存红细胞质量的标准之一是测量储存期间的溶血程度。溶血被认为是RBC 储存质量改变的结果，出现溶血反应出对储存条件的耐受性较差［9］。本研究系统性的纳入储存溶血和渗透性溶血、氧化应激溶血的反应情况，反应献血者因素对储存期间的红细胞保存质量的潜在影响。

1 对象与方法

1.1 研究对象回顾性收集2016年12月至2018年12月期间4 312 名献血者，98.3%（4 239）的红细胞用于储存溶血参数检测。所有献血者均按照身份证资料或者自行报告民族、年龄、性别。其余例数及数量极少献血者被归为“其他”。

1.2 血液成分制备和样品收集使用血站标准操作规程采集全血，离心分离血液成分［10］。红细胞悬液保存在专用冰箱中，温度在（4±2）℃。按无菌接驳从血袋中抽取15 mL 样本置于无菌离心管中，保存32 ～35 d 用于研究。从离心管中取2 份（各1 mL）进行溶血检测，其中1 份自发储存溶血和渗透性溶血，1 份氧化应激溶血。

1.3 溶血检测血细胞比容（压积）、总血红蛋白浓度测定严格按照试剂说明书、操作规程执行［11］。红细胞2 000 r/min 离心5 min，测定上清液中血红蛋白（Hemoglobin，HGB/Hb）含量。（1）储存终点溶血率（%）=（1-血细胞比容）×血浆或上清液游离血红蛋白浓度/总血红蛋白浓度×100%。（2）红细胞渗透脆性试验溶血率（%）=上清液中Hb 浓度/总血红蛋白浓度×100%。（3）氧化应激溶血率（%）=（OD值样品PBS 溶液-OD值纯PBS 溶液）/OD值样品去离子水-OD值纯去离子水）×100%。800 μL 红细胞用磷酸盐缓冲液（PBS）配成6.25%的红细胞悬液，加入终浓度为50 mmol/L 偶氮二异丁脒盐酸盐（2，2'-azobis［2-methylpropionamidine］dihydrochlo⁃ride，AAPH），37 ℃恒温水浴锅中孵育120 min，取50 μL 样品溶液，用酶标仪检测诱导样品的上清液中血红蛋白在540 nm 处的吸光度值（OD值）。样品在去离子水中完全溶血时所释放的血红蛋白在540 nm 处的吸光度值（OD值）作为基础值。

1.4 统计学方法用SPSS 19.0进行统计检验以确定各组差异，定量资料的结果表示为均值±标准差，以P＜0.05 为差异存在统计学意义。

2 结果

2.1 献血者基本情况4 239 名献血者（不包括多次献血者）性别，年龄和民族分布情况见表1。

表1 献血者基本情况Tab.1 basic situation of blood donor ±s

表1 献血者基本情况Tab.1 basic situation of blood donor ±s

民族汉族壮族瑶族回族其他男性（例）1 849 126 138 181 98女性（例）1 496 105 125 135 86男性年龄（岁）35.6±16.0 38.6±13.4 40.7±15.2 34.7±13.2 35.7±14.5女性年龄（岁）37.5±15.7 37.5±13.4 39.5±15.3 36.5±12.3 37.8±14.1

2.2 性别对溶血的影响在保存32 ～35 d 时，储存溶血率平均为（0.37 ± 0.31）%，性别因素在储存溶血（男性0.42%vs.女性0.34%，P< 0.001）和渗透性溶血（男性30.4%vs.女性26.0%，P< 0.001）有显著差异，氧化应激溶血率差异也有统计学意义（P=0.003），见表2。

表2 性别对溶血的影响Tab.2 Effect of the gender on the hemolysis x±s

2.3 民族对溶血的影响壮族、瑶族在储存溶血率，渗透性溶血率与汉族差异存在统计学意义（P<0.05），见表3。

表3 民族对溶血的影响Tab.3 Effect of the nation on the hemolysis

2.4 溶血相关因素的多变量分析献血者的性别、年龄和民族的Logistic 多因素分析，发现储存溶血和渗透性溶血与性别，壮族、瑶族以及年龄显著相关。渗透性溶血中，性别、壮族、瑶族及年龄是独立影响因素。氧化应激溶血倾向受到年龄、性别影响，见表4。

3 讨论

随着临床用RBC日益增多，安全输血制度也在逐渐完善，以提高输血效果，减少输血不良反应［12］。输血医学认为RBC 溶血是RBC 储存损伤的标志［13］，因此当RBC 膜稳定性丧失和溶血时，输注超过21 d 储存期的红细胞可能出现溶血不良反应［14］。

研究［15］表明献血者民族多样性影响冷藏保存RBC 自发性和诱导性溶血，存在献血者红细胞稳定性方面的差异。本研究中仅限于体外测量RBC溶血倾向，结果显示男性和壮族与自发性或渗透性溶血关联最强。与年轻人（年龄20 ～30 岁）相比，老年人（年龄50 ～75 岁）的红细胞氧化应激水平升高，抗氧化活性受损［16］。老年人红细胞中赋予对AAPH 氧化抗性的机制不太可能与性激素有关［17］，正如两性中观察到的类似趋势所表明的那样。多变量综合分析后，储存溶血、渗透性溶血、氧化应激溶血倾向与性别、年龄相关。最近的调查将年龄较大献血者的红细胞输血与输血后死亡风险降低联系起来，这一结果可部分解释以上结果［18］。

表4 溶血相关因素的多变量分析Tab.4 Multivariate analysis of factors related to hemolysis

不同民族间地中海贫血发生率也存在差异［19］。本研究在壮族、瑶族的献血者和渗透性溶血中观察到紧密关联。壮族献血者的红细胞的渗透脆弱性可能源于壮族的献血者中溶血性疾病（例如，镰状细胞病和地中海贫血）的遗传性状的高流行性，国内研究发现壮族和瑶族人群地中海贫血发生率高于汉族，已知其可减少渗透性溶血［20］。另外一项调查也显示壮族人群α 地中海贫血发生率也高于汉族［21］，这些研究均表明不同民族间地中海贫血发生率也存在差异，因此导致红细胞渗透脆弱性的差异。

基于多变量分析的结果，储存溶血、渗透性溶血主要与献血者民族相关，而氧化应激溶血倾向受献血者年龄、性别影响。动物实验中［22］，老年大鼠（24 个月大）与年轻大鼠（4 个月大）相比，红细胞氧化应激水平效果更明显。目前的研究结果强调氧化应激的作用，不仅存在于机体衰老中，而且存在于细胞衰老中［23］。由于氧化应激可能性随着年龄的增长而增加，因此在年龄较大献血者中观察到的对AAPH 溶血抗性的增强可能与多次献血史和其他与年龄相关的因素部分相关，这些因素导致红细胞生成的铁可用性降低［24］。

本研究储存期末溶血率均< 0.8%，量化了献血者情况对储存的红细胞中自发和应激诱导溶血的影响，并重点介绍红细胞献血者性状与溶血可能的相互作用的见解。此类针对国内献血员研究较少，尽管取得一定进展，但考虑到献血员群体的庞大和不确定性，许多问题仍需要进一步研究，例如精确定义与输血高伤害风险相关的溶血表型，以及可能易受年龄、民族以及哪些其他因素导致溶血倾向。当然，如上文所述，影响RBC 储存病变的因素，包括储存时间，血液成分制造方法和献血者因素，还需持续本研究项目，期待进一步优化RBC 储存和储存病变的问题。另外，越来越多的研究关注溶血分子及遗传机制［25-26］，期待从流行病学延伸到机制研究改善捐献者筛选的过程，并减少溶血以及与输血相关的伤害。总之，本项红细胞储存病变相关的献血者背景和讨论中代谢生物标志物也涉及到这一趋势，对于溶血机制、优化红细胞储存条件和献血政策具有参考价值。