篮状菌属岛篮状菌组的两个中国新记录种

王 龙 孙剑秋 金世宇

(1.中国科学院 微生物研究所真菌学国家重点实验，北京 100101；2.绍兴文理学院 生命科学学院，浙江 绍兴 312000；3.北京市京西林场，北京 102300)

0 引言

篮状菌属(Talaromyces)岛篮状菌组(sectionIslandici)的物种通常生长缓慢，形成绒状菌落，并产生蒽醌类次级代谢产物，使得其菌丝呈现橙黄色.这些蒽醌类次级代谢产物通常具有动物毒性，属于真菌毒素(mycotoxins).如T.islandicus(Sopp) Samson, N.Yilmaz, Frisvad & Seifert产生的islandicin, luteoskyrin, erythroskyrin, rugulosin，skyrin等真菌毒素具有肝脏和肾脏毒性并致癌.大米被T.islandicus污染会变成浅橙黄色，称为黄变米，长期食用黄变米会导致肝癌[1].T.radicus(A.D.Hocking & Whitelaw) Samson，N.Yilmaz, Frisvad & Seifert，T.rugulosus(Thom) Samson，N.Yilmaz, Frisvad & Seifert和T.wortmannii(Klöcker) C.R.Benj.主要产生rugulosin和skyrin.rugulosin具有抗金黄葡萄球菌活性[2, 3].有学者发现skyrin是一种非多肽类的小分子降血糖物质[4]，但此后再也没有相关的研究报道.T.rugulosus和T.wortmannii还可以产生多种酶类，如T.rugulosus可以产生芸香苷酶(beta-rutinosidase)和磷酸酶(phoshatase)[5, 6].T.wortmannii可以产生尿烷酶(urethanase)降低尿烷的致癌风险[7].另外，T.wortmannii在土壤中可以分泌挥发性有机物(volatile organic compounds，VOCs)，促进植物种芽生长并增强抗病性[8].岛篮状菌组的种类是非常重要的生物资源，截止到2019年12月，全球该组共报报道了33个种，而我国只发现了8个种[9-12].本文报道该组的2个我国新记录种，即安拉阿巴德篮状菌(T.allahabadensis(B.S.Mehrotra & D.Kumar) Samson，N.Yilmaz & Frisvad)和鸽色篮状菌(T.columbinesS.W.Peterson & Jurjeviĉ).

1 材料与方法

1.1 样品采集和分离

土壤样品采自我国青海省西宁市湟中县塔尔寺和河南省洛阳龙门石窟荒野.样品约25 g置于无菌的塑料袋中封好，记录采集地、基物种类、采集日期、经纬度和采集人信息.样品分离采用Malloch[13]的倍比稀释倾倒平皿法并做了改进，即将样品碾碎，取约1 g样品放入装有9 mL的无菌0.1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)水溶液大试管(20×200 mm)中，盖紧无菌硅橡胶试管塞，震荡混匀成悬浊液，作为第一稀释度10-1.然后迅速取该稀释度的悬浊液1 mL倒入第二个同样的大试管中摇匀，作为第二稀释度，依此类推直到第四个稀释度10-4.取最后2个连续的稀释度的悬浊液约1 mL倾倒于事先倒好的马丁培养基(DRBC，Dichloran rose bengal chloramphenicol)的平皿(规格90 mm)，用无菌涂布棒均匀涂布，于25 ℃倒置培养.从第3天开始观察并挑取单菌落转接于麦芽精琼脂(MEA)的小平皿(规格60 mm)，于25 ℃ 倒置培养7-14天，然后用封口膜封好，于4 ℃保存以待鉴定.分离得到的2株篮状菌12260和14002保存于中国普通微生物菌种保藏中心(CGMCC)，保藏号分别为AS 3.15811和AS 3.15848.

1.2 形态学方法

菌落颜色的描述参照Ridgway[14]的色谱.培养基及培养条件为查氏酵母精琼脂(CYA)25 °C、37 °C，MEA 25 °C，均培养7 d后观察和描述.显微结构观察：取在MEA上生长旺盛时的产分生孢子的结构做载片观察和描述.鉴定参考资料为Raper and Thom、Pitt、Yilmaz，et al的专著和论文[15-17].

1.3 PCR扩增和测序

DNA的提取参考Wang and Zhuang[18].扩增钙调蛋白基因(calmodulin gene，CaM)的引物为AD1: 5′-gccgactctttgactgaagagc-3′和Q1: 5′-gcatcatgagctggacgaactc-3′[19]；扩增rDNA ITS1-5.

8S-ITS2序列(ITS)引物选择ITS5: 5′-ggaagtaaaagtcgtaacaagg-3′和ITS4: 5′-tcctccgcttattgatatgc-3′[20].PCR扩增反应在无菌的0.2 mL薄壁平盖Eppendorf管中进行，20 μL反应体系含有基因组DNA 1.0 μL，正向和反向引物(10 μM)各0.5 μL，双蒸水8 μL，2×PCR扩增缓冲液(0.05 u/μL Taq polymerase，4 mM MgCl2，0.4 mM dNTPs 10 μL).PCR扩增反应程序：94 ℃ 加热3 min；然后共进行34个温度循环：94 ℃ 变性30 s，50 ℃ 退火30 s，72 ℃ 延伸30 s；最后在72 ℃ 延伸5 min.PCR产物各取5 μL与5 μL的100 bp DNA ladder用2.0%的琼脂糖凝胶(agarose gel)在80 V电压下电泳15 min，再用0.5 g/mL的溴乙锭(EB, ehidium bromide)染色10 min后在波长365和254 nm的紫外线下观察.显示单一、明亮扩增区段长度条带的PCR扩增产物(CaM约700 bp，ITS约600 bp)由生物技术有限公司用ABI3730 (Applied Biosystems，Drive Foster City，CA，USA)进行双向直通测序.

1.4 分子种系学分析

原始序列用生物学软件Bioedit 7.0.9[21]进行人工校对、编辑，得到准确无误的全区段序列，提交到GenBank(AS3.15811:CaM=MN857548，ITS=MN847718；AS3.15848:CaM=MN857549，ITS=MN847719).岛篮状菌组物种的模式菌株和本研究的两个菌株的CaM和ITS序列分别用MEGA 6[22]进行对位排列后(alignment)剔除序列不完整的菌株，做成序列矩阵(CaM共有34株，ITS共有31株).然后用最大可能法(Maximum Likelihood，ML)分析，并采用自展法(bootstrap)进行1000次重复评估各分支的可靠性，其中空格(gaps)选择partial deletion[23].

2 结果

通过形态学和基于CaM与ITS的分子种系学分析，确定在青海省西宁市湟中县塔尔寺和河南省洛阳龙门石窟土壤分离到的这两株篮状菌分别为安拉阿巴德篮状菌(T.allahabadensis, AS 3.15811=12260)和鸽色篮状菌(T.columbinus, AS3.15848=14002)，均为我国新记录种(图1-图4).

2.1 安拉阿巴德篮状菌

Talaromyces allahabadensis(B.S.MEhrobtra & D.Kumar) Samson，N.Yilmaz & Frisvad，Stud.Mycol.70: 174.2011(图1)

在查氏酵母精琼脂(CYA)上25 ℃，7 d，菌落直径24-25 mm，较厚，中央稍凹陷，少量辐射状沟纹；边缘完整；质地绒状；分生孢子结构稀疏；菌丝呈钡黄色(Baryta Yellow) (R.Pl.IV)；渗出液无；可溶性色素无；反面橙红色.

在麦芽精琼脂(MEA)上25 ℃，7 d，菌落直径16-18 mm，较厚，凸面，平坦，边缘完整；质地绒状；分生孢子结构稀疏，灰绿色；菌丝浅绿黄色，近于浅鲜绿色Light Viridine Green(R.Pl.VI)；渗出液无；可溶性色素无；反面棕红色.

在查氏酵母精琼脂(CYA)上37 ℃，7 d，菌落直径20-22 mm，菌落特征类似CYA上25 ℃.

分生孢子梗产生于表面菌丝，孢梗茎(60-)90-150(-200) μm× 2-2.5 μm，顶端不膨大，壁光滑；帚状枝双轮生；梗基2-6个每轮，排列不紧密，10-11 μm× 2-2.5 μm；瓶梗安瓿形，排列不紧密，每轮2-6个，10-11 μm× 2-2.5 μm，梗颈较粗较长；分生孢子柠檬形，3-3.5 μm× 2-2.5 μm，壁光滑.

主要特征：生长缓慢，产生绒状菌落，分生孢子稀疏，灰绿色，帚状枝双轮生，排列不紧密，菌丝橙黄色，瓶梗安瓿形，分生孢子柠檬形，壁光滑.

分布和基物：青海省西宁市湟中县塔尔寺土壤(AS 3.15811=12260).

2.1 鸽色篮状菌

Talaromyces columbinusS.W.Peterson & Jurjeviĉ,PLoS ONE 8(10): e78084，2013( 图2)

在查氏酵母精琼脂(CYA)上25 ℃，7 d，菌落直径8-10 mm，较厚，突起，表面具少量辐射状沟纹，边缘于培养基内，波曲状；质地绒状；分生孢子结构大量，深蓝灰色；菌丝体淡橙黄色，边缘白色；渗出液无；可溶性色素无；反面棕黄色.

在麦芽精琼脂(MEA)上25 ℃，7 d，菌落直径10 -12 mm，较薄，中央突起，辐射状沟纹少量，边缘于培养基表面，完整；质地绒状；分生孢子结构大量，暗蓝绿色或灰绿色；菌丝体黄白色；渗出液无；可溶性色素无；反面褐黄色.

在查氏酵母精琼脂(CYA)上37 ℃，7 d，菌落直径25 mm，菌落特征类似CYA上25 ℃.

分生孢子梗产生于气生菌丝，孢梗茎10-60 μm × 3-5 μm，顶端膨大约6 μm，壁光滑；帚状枝双轮生；梗基8-12个每轮，排列紧密，7-10 μm × 3-4 μm，顶端膨大约5 μm；瓶梗披针形或圆柱形，排列紧密，每轮4-6个，7-9 μm× 2.5-3 μm，梗颈较长；分生孢子变化较大，球形至椭球形，3-5 μm× 3-4 μm，壁光滑.

主要特征：生长较慢，产生致密绒状菌落，分生孢子蓝灰色，帚状枝典型双轮生，排列紧密，孢梗茎和梗基顶端膨大，球形至椭球形或梨形，壁光滑.

分布和基物：河南省洛阳龙门石窟荒野土壤(AS 3.15848=14002).

3 讨论

从菌落形态学看，发现于我国的T.allahabadensis菌株AS 3.15811与模式菌株CBS 453.93生长速率非常相近，虽然它们的产孢能力差别较大，AS 3.15811在CYA和MEA上产生稀疏分生孢子，而CBS 453.93则产生大量深灰绿色分生孢子，但其显微结构完全相同.另外，它们的CaM序列一个碱基也不差，ITS序列只相差1个碱基，而且基于CaM和ITS分子系统学分析显示这两株菌以100%的支持率聚在一起.我国的T.columbinus菌株AS 3.15848比模式菌株NRRL 5881生长稍慢，在CYA和MEA上产分生孢子比NRRL 5881更多[24-26].但其CaM和ITS序列以及显微形态完全相同，而且CaM和ITS分子系统发育树也显示这两株菌以100%的支持率聚在一起(图3, 4).因此，可以确认我国的这2株菌鉴定无误.

本研究报道的Talaromycessect.Islandici这两个我国新纪录种在我国尚属罕见，在作者长达20多年的青霉与曲霉的物种调查及分类工作中属于首次发现，而且只发现于青海(T.allahabadensis)和河南(T.columbinus)两省。但根据国际报道，这两个种分布范围应该较广泛，如T.allahabadensis发现于印度、泰国、墨西哥及欧洲等地，T.columbinus则发现于美国和肯尼亚[27].可能是该两种生长缓慢，在分离培养过程尚未长出就被快速生长的种类覆盖.在本研究中我们对Malloch的分离方法做了改进，采用0.1%羧甲基纤维素钠(CMC-Na)代替水作溶剂制作土壤悬浊液，土壤微粒可以悬浮于溶剂不易沉淀，因而分散效果较好，这样涂平板后样品散布均匀.而且从培养第3天开始观察并挑取单菌落，此时生长缓慢的物种已长出微小菌落而尚未被生长快速的物种覆盖便被挑出.采用本改进的分离方法可以成功分离到土壤稀有物种或生长缓慢的物种.