雉鸡微卫星多态性分析

2020-05-21赵乐乐袁红艳张春华陆雪林

养殖与饲料 2020年2期

邢磊赵乐乐袁红艳张春华陆雪林*

1.上海市动物疫病预防控制中心，上海201103；2.上海欣灏珍禽育种有限公司，上海201408

微卫星（SSR）标记技术对加快畜禽性状选育有很大的优势[1]，关于雉鸡的分子标记研究以前尚未有过，而且雉鸡的基因组信息也是未知的。因此，本研究利用高通量测序技术以雉鸡基因组为研究对象对雉鸡的SSR 分子标记进行开发，构建出雉鸡SSR 分子标记数据库，迈开了进行雉鸡分子标记遗传研究的第一步。通过设计特异性引物并经过样本群体的多态性验证[2]，得到了可靠的多态性SSR 标记，旨在为雉鸡种质资源遗传多样性研究、基因定位以及分子标记辅助育种提供分子水平上的有效工具[3]。

1 材料与方法

1.1 试验动物

试验动物来源于上海欣灏珍禽育种有限公司饲养的中华环颈雉（RN）、蒙古雉（MX）和国内雉鸡（D）的纯种后代。3 个品种在同一鸡舍、相同管理条件下饲养。

1.2 血液样本采集及基因组提取

第20 周时，从试验群体中随机挑选105 只母鸡采集血样，各样本翅静脉取血3 mL，4% EDTA抗凝剂抗凝，-20 ℃保存。利用试剂盒法（天根生化（DP318）血液基因组提取试剂盒）提取血样基因组，采用TBS380 结合picogreen 进行浓度和纯度检测，再根据浓度检测结果利用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测样本DNA 的完整性，电压120 V，时间20 min。所得DNA 于-20 ℃储存备用。

1.3 微卫星标记的引物设计及筛选

通过454 平台高通量测序，利用MISA 程序在序列中搜索SSR 位点，利用primer3_2.2.3 对搜索得到的SSR 位点设计特异性引物。扩增目标片段为重复序列前1 个碱基到后5 个碱基的片段，扩增产物长度在100～400 bp 之间。设计引物时，遵循一般的引物设计原则，并对PCR 产物长度及范围、引物退火温度范围、GC 含量、长度等进行严格限定，从而进行相关参数的调整。然后选择分布均匀的SSR 位点通过90 个样本逐级PCR 反应筛选多态性位点。PCR 反应体系总体积为20 μL，其中ddH2O 14 μL，10×Buffer 2 μL，DNA 模板1 μL，上、下游引物各0.50 μL，dNTP 0.5 μL，Taq 酶0.5 μL。PCR 扩增反应程序为：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35 次循环；最后72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。

1.4 微卫星标记的基因型判定及数据分析

利用确定的8 对多态性SSR 设计荧光引物上ABI 3730XL 测序仪进行毛细管电泳，进而进行基因型判定并进行数据分析。用POPGENE3.2 统计观测等位基因数（Na）、有效等位基因数（Ne）、观测杂合度（Ho）、期望杂合度（He）等。多态信息含量（PIC）用软件LittlePrograme 计算。

2 结果与分析

经过逐级多态性验证，最终确定8 条多态性SSR 序列，具体信息见表1。8 对微卫星在所有雉鸡个体中均能成功扩增。

观测等位基因数、有效等位基因数、观测杂合度、期望杂合度见表2，多态信息含量见表3。由表2可知，RN 群体中，观测等位基因数平均为5.38，每个位点从1（zll-12）到9（zll-30 和zll-68）不等，有效等位基因数平均为3.64。MX 群体中，观测等位基因数平均为5.75，每个位点从2（zll-12）到10（zll-68）不等，有效等位基因数平均为3.65。D 群体中，观测等位基因数平均为5.13，每个位点从2（zll-12）到11（zll-30）不等，有效等位基因数平均为3.45。对8个微卫星标记群体杂合度计算结果（表2）显示，RN群体平均观察杂合度、期望杂合度、Nei 期望杂合度分别为0.60、0.60、0.59；MX 群体平均观察杂合度、期望杂合度、Nei 期望杂合度分别为0.60、0.62、0.61；D 群体平均观察杂合度、期望杂合度、Nei 期望杂合度分别为0.56、0.61、0.59。

根据表3 统计结果可知，8 个位点在RN、MX、D 三个群体中，除zll-12、zll-61 的PIC 小于0.5 外，其余6 个位点的PIC 值均高于0.5，说明所选取的位点大多为高多态位点（图1）。zll-30 与zll-68 的多态信息含量在3 个群体中均较高，zll-30 在D 群体中多态信息含量达0.89，zll-68 的多态信息含量在3 个群体中均超过了0.83。

3 讨论

因为国内雉鸡品种（D）和由美国引进的原种雉鸡2 个品种中华环颈雉（RN）和蒙古雉（MX）属于同一物种，因此从3 个品种中随机选择国内雉鸡品种（D）的1 个样本进行高通量测序，从而得到雉鸡所拥有的SSR 位点。雉鸡并没有基因组序列和注释信息可进行参考，只能按照无参考基因组序列的物种进行SSR 分子标记的开发，然后通过PCR 和一代测序试验验证方法筛选出可用的SSR 分子标记。针对未知基因组信息的雉鸡群体，采用454 测序平台结合SSR 富集文库测序的高通量测序方法进行雉鸡SSR 分子标记的开发，很好地解决了近缘物种引物交叉扩增所带来的无PCR 产物的高风险，而且454 平台能够提供足够的侧翼序列用于特异性PCR引物设计[4]。SSR 富集文库的构建能够减少测序数据量，降低测序成本，提高开发效率，分析手段目标更明确、更经济、快速、高效，也为研究其他未知基因组信息的物种的分子标记提供了思路和方法。

表1 多态性SSR 引物信息

表2 雉鸡群体的等位基因数和杂合度

表3 雉鸡群体的多态信息含量

图1 三个群体中8 个微卫星位点PIC 含量分布

有效等位基因数越接近所检测到的等位基因的绝对数，表明等位基因在群体中分布越均匀[5]。本研究中8 个微卫星标记在雉鸡群体中有效等位基因数最小为1，最大为8.45，反映出8 个微卫星标记的等位基因在群体中分布不均匀。基因杂合度被认为是度量群体遗传变异的最适参数。杂合度越低，表明该群体遗传一致性越高，遗传多样性也越低[6]。对于分子遗传标记，Helentjaris 等[7]提出用多态信息含量值（PIC）衡量基因变异程度高低、反映遗传信息的多少。多态信息含量是等位基因频率和等位基因数的变化函数。当位点PIC＞0.5 时，该位点为高度多态位点；当位点0.25＜PIC＜0.5 时为中度多态位点；当PIC＜0.25 时为低度多态位点。zll-30 与zll-68的多态信息含量在3 个群体中均较高。多态信息含量（PIC）和遗传杂合度（He）都是表示群体内遗传变异的指标。从保种的角度来考虑，我们要保持品种的遗传多样性，只有PIC 和He 数值大，才能说明群体遗传多样性比较丰富。所以，由表2 和图1 可知，本研究所选雉鸡群体的遗传多样性非常丰富，这与雉鸡的实际繁养情况相符合。因为国内雉鸡养殖长期处于散养状态，并且没有受到高强度的选择。