新疆巴州地区奶牛隐性乳房炎金黄色葡萄球菌的分离鉴定与耐药性分析

马 博 卜三平 周鸿淼 王艳萍 刘 鸽

1.巴音郭楞职业技术学院，新疆库尔勒841000；2.新疆维吾尔自治区畜牧总站，乌鲁木齐830000

奶牛乳房炎（mastitis）也称乳腺炎，是泌乳牛乳腺细胞受到化学、物理和致病微生物等多种因素影响而产生的一种炎症反应，是奶牛场中常见的疾病之一，严重影响奶牛场的经济效益。根据有无临床症状和患病的严重程度，分为临床型乳房炎和隐性乳房炎，临床型乳房炎常伴有红、肿、热、痛症状。引起奶牛乳房炎的细菌种类众多，约150 种[1-5]，3 种最为常见的致奶牛乳房炎致病菌为大肠杆菌、链球菌和金黄色葡萄球菌。研究[6-10]证明，金黄色葡萄球菌的危害最大，金黄色葡萄球菌可产生致热性外毒素、杀白细胞素、肠毒素、剥脱毒素、溶血毒素和中毒性休克综合症毒素等，容易引起奶牛乳腺组织不可修复的损伤；导致金黄色葡萄球菌引起的乳房炎治愈率低的另一个重要因素是金黄色葡萄球菌易对抗生素产生耐药性[11-13]。分子生物学在21世纪的生命科学领域占有重要位置，其中的聚合酶链式反应（PCR）检测技术是一种在体外扩增目的DNA 片段的技术，具有灵敏度高、特异性强、快速简便（2 d左右）、取材方便等诸多优点，在细菌检测中应用广泛[14]。本文主要针对新疆巴州地区库尔勒市、轮台县、尉犁县、若羌县、且末县、焉耆县、和静县、和硕县、博湖县共八县一市规模化奶牛场奶牛隐性乳房炎做抽样调查，从患隐性乳房炎奶牛的乳汁中分离鉴定金黄色葡萄球菌，分别从金黄色葡萄球菌的形态学、生物化学、分子水平等方面鉴定巴州八县一市规模化养殖场的奶牛隐性乳房炎的金黄色葡萄球菌的阳性率，并进行了部分耐药性分析，为控制奶牛隐性乳房炎的发病率和奶产量下降提供科学的理论依据和数据支撑。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1）样品来源。分别从巴州地区库尔勒市、轮台县、尉犁县、若羌县、且末县、焉耆县、和静县、和硕县、博湖县共八县一市规模化奶牛场各抽检200 头泌乳奶牛的800 份乳样，共计7 200 份乳样（200 头/区域×9 个区域×4 乳区/头=7 200 个乳样）。抽检的奶牛全为澳系的荷斯坦泌乳奶牛。

2）主要仪器。超净工作台、恒温箱（青岛）、磁力加热搅拌器（78-1 型）、PCR 仪（TC-512）、高速冷冻离心机（Multifuge X1R）、凝胶成像仪（Bio-Rad）、电泳槽（Power Wave XS2）、电泳仪（DYY-6B）、50 mL乳样收集管、蒸馏水瓶、乳房炎诊断盘等。

3）主要试剂。兰州隐性乳房炎诊断试剂（LMT）、蒸馏水、琼脂糖、革兰氏快速染色液、TaqDNA 聚合酶、DL-2000 DNA Marker（大连）、细菌基因组DNA提取试剂盒（北京睿博兴科生物）；普通营养琼脂培养基、鲜血培养基、金黄色葡萄球菌选择性培养基（也称高盐甘露醇培养基）、甘露醇发酵试验生化鉴定培养基、麦芽糖培养基、葡萄糖培养基、蔗糖培养基、乳糖培养基、兔鲜血培养基[15-18]（配方中均按加100 mL 蒸馏水计算，如需要更多，可以根据倍数关系成倍增加配方中的其他物质，但pH 不能改变）；丁胺卡那、卡那霉素、多西环素、恩诺沙星、环丙沙星、克林霉素、青霉素、阿莫西林、头孢氨苄、庆大霉素、链霉素、四环素12 种抗生素。

①金黄色葡萄球菌选择性培养基：牛肉膏粉末0.2 g、蛋白胨2.0 g、D-甘露醇2.0 g、氯化钠3.0 g、琼脂粉末3.0 g、酚红0.005 g，充分搅拌摇匀，调节pH至7.4，放121 ℃高压灭菌20 min。

②LB 液体培养基：在锥形瓶中加酵母浸粉0.5 g、氯化钠1.0 g、胰蛋白胨1.0 g、蒸馏水100 mL，将混合物摇匀，调节培养基的pH 在7.4～7.6 范围内。如混合物溶解不好，可用电热套适当加热，121 ℃高压灭菌20 min。

③LB 固体培养基：在锥形瓶中加酵母浸粉0.5 g、氯化钠1.0 g、胰蛋白胨1.0 g、蒸馏水100 mL，将混合物摇匀，调节培养基的pH 在7.4～7.6 范围内，加入琼脂粉1.8 g。将锥形瓶密封好后，放高压锅121 ℃高压环境下灭菌20 min，可即时分装试管（已经高压灭菌过），将试管立于斜面上，使培养基降温后成斜面；也可放好备用，但需要将LB 固体培养基在电热套上加热，使之完全溶解，倒LB 固体培养基过程中要注意无菌操作。

④邓亨氏水：称蛋白胨2.0 g、氯化钠1.0 g，调节pH 至7.6，以备配制其他培养基使用。

⑤麦芽糖培养基：称麦芽糖2.0 g，用制备好的邓亨氏水100 mL 使其溶解，加0.4 mL 1.6%溴甲酚紫（酒精）指示剂，然后试管分装，115 ℃灭菌20 min。

⑥葡萄糖培养基：称葡萄糖粉1.0 g，用制备好的邓亨氏水100 mL 使其溶解，加0.4 mL 1.6%溴甲酚紫（酒精）指示剂，然后试管分装，115 ℃灭菌20 min。

⑦蔗糖培养基：称量蔗糖1.0 g，用制备好的邓亨氏水100 mL 使其溶解，加0.4 mL 1.6%溴甲酚紫（酒精）指示剂，然后试管分装，115 ℃灭菌20 min。

⑧乳糖培养基：称乳糖1.0 g，用制备好的邓亨氏水100 mL 使其溶解，加0.4 mL 1.6%溴甲酚紫（酒精）指示剂，然后试管分装，115 ℃灭菌20 min。

⑨兔鲜血培养基：采集兔血5～10 mL（常用心脏采血法，根据倒平板的多少来定），在注射器中提前抽取一定量的自配抗凝剂，采集血量要满足抗凝剂的比例为5%，将兔鲜血和抗凝剂的混合物加入高压灭菌好的LB 固体培养基中（温度不宜太高，否则会使兔血变成暗红色，温度40～50 ℃为宜），摇匀，在已经用紫外线消毒好的净化工作台内倒入平板。

1.2 试验方法

1）隐性乳房炎的检测及奶样的采集。随机从巴州地区的八县一市规模化养殖场各抽检200 头奶牛，共1 800 头奶牛的7 200 个乳区乳样，使用LMT（图1）进行隐性乳房炎的检测，以此确定八县一市奶牛隐性乳房炎发病率。整体方案是采用现场采集乳样、现场检测的方法，将被检乳样为阳性的做好标记。具体采集乳样的方法为：使用干净棉质温热毛巾将预采样的奶牛乳房和乳头擦拭干净，注意换洗毛巾，保持清洗桶内水的干净清澈，使用0.5%碘伏溶液对乳头药浴1 min 左右，使用75%的酒精喷洒整个乳房，将碘伏溶液冲洗干净，使用卫生纸将乳房和乳头擦拭干净，挤掉前3 把奶后，将50 mL 乳样收集管置于奶牛乳房下并收集满待检乳样，挤奶过程防止污染收集管；将待检乳样20 mL 左右倒入检测盘的检测杯内，将检测盘倾斜，弃去多余乳汁，使检测杯内留下约2 mL 乳样，再将稀释好的LMT 2 mL 挤入每个检测杯中，水平同心圆摇动35 s，使乳样与LMT 充分混合，根据混合物的沉淀情况确定待检乳样的乳房炎阴阳性，见图2。取待检乳样LMT 阳性的乳样2 mL 于高压处理的EP管内，-20 ℃保存备用。

2）金黄色葡萄球菌的分离、纯化培养。分别蘸取LMT 阳性的乳样到普通营养肉汤培养基中，置37 ℃恒温箱中培养24 h。在金黄色葡萄球菌选择性平板培养基上划线接种培养，置37 ℃恒温箱中18～24 h[19]。金黄色葡萄球菌选择性培养基上菌落生长良好时，在经紫外线照射消毒好的超净工作台中使用接种环挑取单个典型菌落，在兔鲜血培养基上划线培养，37 ℃恒温箱中培养18～24 h。革兰氏染色，镜检，观察菌体的染色特性和形态。将镜检为金黄色葡萄球菌的菌落接种到金黄色葡萄球菌液体培养基中培养，起到增殖的目的。

图1 兰州隐性乳房炎诊断试剂（LMT）

图2 在检测盘中使用（LMT）检测乳样

3）金黄色葡萄球菌的生化鉴定。对培养的待检细菌分离、纯化、培养后，进行生化鉴定：血浆凝固酶试验、过氧化氢酶试验、蔗糖发酵试验、麦芽糖发酵试验、乳糖发酵试验、甘露醇发酵试验，对照《常见细菌系统鉴定手册》，观察试验结果[20-24]。

4）金黄色葡萄球菌的16S rRNA 鉴定。参考16S rRNA 基因测序法，完成16SrDNAPCR扩增。上游引物为：5’-CGAAAGCCTGACGGAGCAAC-3’；下游引物为：5’-AACCTTGCGGTCGTACTCCC-3’（六合华大基因科技合成）。参照细菌基因组DNA提取试剂盒操作步骤提取金黄色葡萄球菌菌株的基因组DNA。以基因组DNA 为模板扩增16S rRNA基因，PCR 法采用20 μL 反应体系：ddH2O 8 μL，PCR Mix 8 μL，模板2 μL，上、下游引物均1.0 μL；反应条件：95 ℃预变性10 min；94 ℃变性45 s，55 ℃退火50 s，72 ℃延伸1 min，30 个循环；72 ℃延伸10 min。

5）金黄色葡萄球菌的耐药性分析。使用药敏纸片进行药敏试验，对丁胺卡那、卡那霉素、多西环素、恩诺沙星、环丙沙星、克林霉素、青霉素、阿莫西林、头孢氨苄、庆大霉素、链霉素、四环素12 种抗生素进行耐药性试验，判定标准见表1。

表1 耐药性试验判定标准

2 结果与分析

2.1 乳样LMT 检测结果

巴州地区八县一市规模化养殖场1 800 头奶牛中隐性乳房炎奶牛头数为432 头，患病率为24%（432/1 800），具体见表2；432 头隐性乳房炎奶牛的1 728 个乳区中有1 296 个患乳房炎阳性乳区，乳区患病率为18%（1 296/7 200）。

表2 巴州地区八县一市抽检奶牛乳房炎发病率

2.2 金黄色葡萄球菌菌株的分离与鉴定

37 ℃恒温培养24 h，乳房炎阳性分离菌株在普通肉汤培养基上和兔鲜血琼脂培养基上均生长良好。观察在兔鲜血琼脂培养基上金黄色葡萄球菌生长的形态特征为圆形、灰白色，表面光滑、隆起、湿润，菌落周围有β 溶血现象（图3）。在普通琼脂培养基上培养，菌落生长良好，形态特征为圆形、表面光滑、隆起、湿润、菌落边缘整齐，直径大小为1.0～2.5 mm 的菌落。在金黄色葡萄球菌选择性培养基上培养，菌落形态为圆形、黄色、湿润、边缘整齐（图4）。分离菌革兰氏染色后镜检，观察到圆形、革兰阳性，有的呈单个，有的呈短链状，还有的呈现出葡萄串的形状（图5）。

图3 血平板生长情况

图4 甘露醇生长情况

图5 显微镜观察情况

2.3 生化鉴定结果

进行生化鉴定的试验结果：过氧化氢酶试验、血浆凝固酶试验全都为阳性，可发酵蔗糖、麦芽糖、甘露醇。按照《常见细菌系统鉴定手册》的相关知识，将分离到的菌与之对照，分离细菌的生化鉴定结果符合金黄色葡萄球菌的生化鉴定，试验结果判定52 株分离菌都是金黄色葡萄球菌。

2.4 分离株的16S rRNA 扩增

对52 株奶牛乳房炎金黄色葡萄球菌分离株引物扩增16S rRNA 基因后，分离菌株均得到了大小为528 bp 的目的片段（图6）。

图6 金黄色葡萄球菌16S rRNA PCR 扩增

2.5 分离株的药敏结果

52 株金黄色葡萄球菌对青霉素、链霉素、环丙沙星的耐药率为100%，对阿莫西林的耐药率为80.8%（42/52），对庆大霉素、丁胺卡那、卡那霉素、头孢氨苄的耐药率为5.7%（3/52），对多西环素、克林霉素、四环素的耐药率0%（0/52）。并出现了25 株菌多重耐药性，所占比例为48%（25/52）。

3 讨论

对新疆巴州地区库尔勒市、轮台县、尉犁县、若羌县、且末县、焉耆县、和静县、和硕县、博湖县共八县一市规模化奶牛场各抽检200 头泌乳奶牛的800份乳样，共计1 800 头奶牛、7 200 份乳样。1 800头奶牛中隐性乳房炎奶牛数为432 头，患病率为24%（432/1 800），而其他多个奶牛场的金黄色葡萄球菌致奶牛乳房炎发病率为30%以上[25-27]。虽然相对偏低，但也证实存在金黄色致病菌感染的病例，应引起畜牧工作者的高度重视。432 头隐性乳房炎奶牛的1 728 个乳区中有1 296 个患乳房炎阳性乳区，乳区患病率为18%（1 296/7 200）。对患隐性乳房炎的奶牛乳样进行金黄色葡萄球菌的分离和形态学、生物化学、分子水平等方面鉴定，共分离得到52 株金黄色葡萄球菌。

试验分离到的52 株金黄色葡萄球菌对青霉素、链霉素、环丙沙星的耐药率为100%，对阿莫西林的耐药率为80.8%（42/52），对庆大霉素、丁胺卡那、卡那霉素、头孢氨苄的耐药率为5.7%（3/52），对多西环素、克林霉素、四环素的耐药率为0%（0/52）。并出现了25 株菌多重耐药性，所占比例为48%（25/52），说明耐药性在细菌病的治疗过程中是非常普遍的现象[28]。治疗奶牛场中患乳房炎奶牛仍以抗生素疗法为主，这引起了致病细菌耐药性的问题和乳制品食品安全问题；针对细菌耐药性问题，可以尝试使用中草药、抗菌肽、噬菌体等无抗疗法。研究发现，金黄色葡萄球菌致病力的强弱主要与其产生的侵袭性酶类和各种毒素有关[29]。

引发奶牛乳房炎的因素是多方面的，主要分致病菌因素、管理因素和遗传因素。不同地区引发奶牛乳房炎的致病菌的种类存在差异，但链球菌、肠杆菌和金黄色葡萄球菌仍是主要的致病菌。而多数金黄色葡萄球菌菌株都携带肠毒素基因，严重影响奶牛乳腺细胞正常的生理功能[30-32]。金黄色葡萄球菌极易产生耐药性，疫苗生物制剂是预防金黄色葡萄球菌乳房炎的重要手段；治疗金黄色葡萄球菌乳房炎也需要一些像抗菌肽、中草药和噬菌体等新型的无抗生素治疗方案，有效避免细菌产生耐药性，把好乳源食品安全关。饲养管理不当容易导致奶牛养殖环境的温度、湿度、通风等不适，从而引发致病菌的滋生；挤奶厅的挤奶操作不规范，极易导致奶牛乳区受伤，引发致病菌从伤口感染乳区的情况出现；营养不良或者不均衡也是导致奶牛乳房炎一个重要的致病因素[33]。从临床数据发现，患乳房炎的奶牛的雌性后代的乳房炎患病率明显偏高，存在遗传物质的影响。饲养环境对奶牛乳房炎的影响较大，应做好奶牛场的管理工作。同时，采用某一种或者多种致病菌的单苗或者多价苗进行免疫预防，是预防奶牛乳房炎的重要方法；搞好奶牛饲养圈舍和运动场的环境消毒工作非常重要，要制定针对本饲养场的消毒计划和使用行之有效的消毒药品；及时将患乳房炎的奶牛与其它健康的奶牛隔离饲养，积极治疗患病奶牛，及时淘汰生产性能较低且患病的奶牛。

奶牛乳房炎历史悠久，尽管生物技术在21世纪得到了不断发展，仍很难彻底解决奶牛乳房炎问题[34]；有研究人员通过生物技术利用金黄色葡萄球菌产生的毒素、荚膜和侵袭性酶等细胞因子或者结构正在努力尝试研发多种亚单位疫苗，用于奶牛乳房炎的预防[35]。