慢性髓系白血病患者SHP-1基因、id4基因甲基化状态及其与疾病进展的关系

郑伟，侯志新，刘承祥，张雷，韩松

慢性髓系白血病(CML)多起源于多能干细胞，其起病缓慢，且临床症状无特异性，因此早期诊断较为困难[1]。相关资料显示，DNA甲基化是表观遗传学修饰的重要方式之一，且其与造血系统恶性肿瘤的发生、发展密切相关[2]。研究指出，抑癌基因启动子甲基化可造成基因沉默，是CML发生、发展的重要分子机制[3]。而含SH-2结构域的磷酸酶1(SHP-1)为胞质酪氨酸磷酸酶，其可对下游信号蛋白分子产生脱磷酸化作用，从而有效调节造血细胞的功能[4]。另DNA结合抑制因子4(id4)为抑癌基因的一种，其主要存在于各类生物细胞中，可被甲基化，从而抑制基因表达。而目前关于二者甲基化状态与CML疾病进展的关系研究报道较少。基于此，本研究探讨CML患者SHP-1基因、id4基因甲基化状态及其与疾病进展的关系，以期为临床防治提供参考。现将结果报道如下。

1 资料和方法

1.1 临床资料 选取2015年5月—2019年5月中国人民解放军联勤保障部队第九六四医院血液科收治CML患者78例为研究对象(病例组)，男43例，女35例；年龄9～71(42.68±3.80)岁。根据病情程度分为慢性期24例，加速期30例，急变期24例；选取同期于医院健康体检者42例作为健康对照组，男23例，女19例；年龄8～70(42.06±3.28)岁。2组性别、年龄比较差异无统计学意义(P>0.05)，具有可比性。本研究经医院医学伦理委员会批准，研究对象均知情同意并签署同意书。

1.2 选择标准 (1)纳入标准：①CML患者符合“中国慢性髓性白血病诊断与治疗指南”(2016版)[5]诊断标准；②CML分期明确者；③临床资料完整，能够配合完成本次研究者。(2)排除标准：①严重心、肝、肾等功能障碍者；②合并其他恶性肿瘤者；③妊娠及哺乳期妇女；④有智力或精神障碍不能配合者。

1.3 观测指标与方法

1.3.1 白细胞提取：取患者骨髓5 ml，肝素抗凝，并加入淋巴细胞分离液5 ml，使用低温高速离心机(Hreaeus，德国，Sigma3-18K)进行离心，弃上清,细胞计数。再继续加入PBS缓冲液5 ml，离心后在CO2培养箱(Hreaeus，德国，WCI-180)37℃中进行传代培养，最后将细胞进行液氮冻存待测。

1.3.2 mRNA基因表达：采用荧光定量PCR技术进行检测，细胞总RNA的提取使用Trizol试剂(美国Invitrogen公司)。

1.3.3 MS-PCR法检测SHP-1、id4基因启动子甲基化状态：(1)白细胞复苏。离心管预热(培养液10 ml)，冻存管置于38℃恒温水浴箱(天津市恒奥科技发展有限公司，HWT-6B)水浴，冻存细胞吸入离心管，离心，弃上清，加入新鲜培养液混匀(10 ml)，再次离心弃上清。(2)DNA提取。收集细胞，离心，弃上清，加PBS缓冲液(180 μl)，混匀，加Proteinase K 20 μl(混匀、室温孵育2 min)，加10% SDS 10 μl，加无水乙醇200 μl，全部溶液置入吸附柱，离心，弃流出液，加CB溶液500 μl，离心，弃流出液，加WBI溶液500 μl，离心，弃流出液，DNA洗脱，-20 ℃ 保存备用。(3)DNA浓度测定。DNA提取后，进行电泳同时使用紫外线分光光度计(德国SPECTRO)测OD值。(4)DNA修饰。按照Methylamp DNA Modification Kit 说明严格操作。(5)PCR扩增。使用PCR扩增仪(上海之江生物科技股份有限公司)，PCR体系为25 μl ，其中DNA 2 μl ，上游、下游引物各为2.5 μl ，绿色PCR体系12.5 μl ，ddH2O 5.5 μl 。引物序列见表1。PCR条件：94 ℃ 预变性5 min，94 ℃ 变性45 min，54 ℃ 退火45 s，40个循环；72 ℃延伸10 min。(6)产物检测。制胶、凝固、上样、电泳(120 V，35 min)(电泳仪，北京六一生物科技有限公司)，凝胶成像系统分析仪(上海复星实业股份有限公司)下摄片。

表1 MS-PCR引物序列及产物长度

注：SHP-1甲基化(M)、SHP-1非甲基化(U)、id4甲基化(M)、id4非甲基化(U)引物

2 结 果

2.1 2组SHP-1、id4基因表达水平比较 2组患者SHP-1、id4基因表达水平比较，健康对照组>慢性期>加速期>急变期，差异有统计学意义(P<0.01)，但加速期、急变期比较，差异无统计学意义(P>0.05)，见表2。

表2 2组受试者SHP-1、id4基因表达水平比较

注：与健康对照组比较,aP<0.05；与CML慢性期比较，bP<0.05

2.2 2组SHP-1、id4基因启动子甲基化率比较 健康对照组SHP-1、id4基因甲基化阳性率均为0；病例组慢性期分别有6例(25.00%)、0例，加速期分别为29例(96.67%)、20例(66.67%)，急变期分别为24例(100.00%)、17例(70.83%)。加速期及急变期CML患者SHP-1、id4基因甲基化阳性率显著高于健康对照组及慢性期，差异均有统计学意义(P<0.01)，见表3。

表3 2组受试者SHP-1、id4基因基因启动子甲基化率比较 [例(%)]

2.3 MSP法测定SHP-1、id4蛋白凝胶成像图 CML患者骨髓SHP-1、id4基因甲基化扩增产物大小分别为158/158 bp、155/156 bp。甲基化扩增结果显示，SHP-1基因、id4基因在健康者中呈非甲基化阳性，在CML患者中呈甲基化状态。见图1。

SHP-1基因

id4基因

注： M、U分别代表甲基化阳性、非甲基化阳性；图1、2中1～5分别代表CML患者骨髓标本甲基化与非甲基化结果，6～7为正常者骨髓标本甲基化与非甲基化结果

图1 SHP-1基因和id4基因甲基化凝胶成像图

3 讨 论

CML多发于50岁以上人群，骨髓髓系增生、外周血白细胞增多及脾脏肿大是其主要特征[6]。相关研究指出，CML可分为慢性期、加速期及急变期，其起病缓慢，且在慢性期症状表现无特异性，因此易被忽视。而进展期常表现为脏器浸润，并出现恶化，急变期预后较差，可危及患者生命，因此早期发现CML尤为重要。目前关于CML疾病进展的分子机制尚不明确，但有研究认为，CML不同时期基因甲基化差异显著。邵明等[7]研究表明，细胞转化进程中，甲基化现象的出现要明显早于恶性表型，因此相关基因的甲基化检测对肿瘤的早期发现及防治具有重要意义。

甲基化为蛋白质和核酸一种重要的修饰，其可对基因的表达和关闭进行调节，并与肿瘤疾病关系密切[8]。据文献报道，基因整体甲基化的降低及CpG局部甲基化的异常升高是造成癌症的一个重要原因。当启动子区CpG甲基化异常升高时，可造成基因沉默发生，在癌症中即表现为抑癌基因表达降低或不表达，从而促进肿瘤细胞的增殖[9-10]。表观遗传学指出，对于基因失活现象的治疗主要以抑制DNA甲基化及组蛋白脱乙酰基两方面进行[11]。而SHP-1基因、id4基因均为抑癌基因，二者在CML疾病进展中的作用机制尚不明确，是否参与CML的发生及发展需要进一步的研究。

SHP-1基因主要存在于造血细胞中，其可对下游信号蛋白分子磷酸酪氨酸进行脱磷酸化，从而实现受体酪氨酸激酶、抗原受体复合物等信号通路的调控，进一步对造血干细胞的增殖与凋亡进行调控[12-13]。现国内外较多文献指出，SHP-1基因结构异常在CML中较为少见，其失活机制多表现为启动子的甲基化。且刘晓等[14]通过研究发现，SHP-1基因在正常者中均不呈现甲基化，而在CML患者中，其甲基化阳性率随CML病情程度的加重而升高。本研究中，健康对照组SHP-1基因mRNA表达水平显著高于病例组各期，CML慢性期患者显著高于CML急变期、加速期患者，且健康对照组甲基化阳性率为0，CML慢性期、加速期及急变期的甲基化阳性率分别为25.00%、96.67%、100.00%。该结果与上述研究结论相符，具有一致性，提示CML中，SHP-1基因失活或沉默现象可能为其启动子的甲基化。而id4基因为螺旋—环—螺旋转录因子亚家族的一员，其多存在于各类生物细胞中。资料显示，id分子本身缺少DNA结合所需要的碱性氨基酸序列，因而与bHLH结合后，可形成异二聚体结构，从而对bHLH与DNA的结合产生抑制作用，进而阻抑细胞分化[15]。因此id4基因可作为抑癌基因，而当其被甲基化后，会导致基因发生沉默，基因表达产生抑制，从而促进肿瘤发生。本研究显示，CML加速期及急变期id4基因mRNA表达水平均低于慢性期，且健康对照组及慢性期CML组中，甲基化阳性率均为0，而CML加速期及急变期的甲基化阳性率分别为66.67%、70.83%，与慢性期及健康对照组差异显著。提示id4基因mRNA表达受限与CML疾病的发生发展密切相关，且其甲基化可作为预测CML疾病进展的标志因子，对CML的诊断及治疗具有积极意义。

综上所述，SHP-1基因、id4基因在健康者中呈非甲基化，在CML慢性期甲基化较低，在加速期或急变期则呈高甲基化状态，因而其甲基化可作为预测CML疾病进展的标志因子，对CML的诊断及治疗具有积极意义。本研究不足为样本量偏小，仍有待进一步行大样本研究证实。

利益冲突：所有作者声明无利益冲突

作者贡献声明

郑伟：设计研究方案，实施研究过程，论文撰写；侯志新：提出研究思路，分析试验数据;刘承祥：实施研究过程，资料搜集整理;张雷：进行统计学分析;韩松：课题设计，论文修改，论文审核