挥发性有机物检测在结直肠癌筛查中的研究进展

郭颖韵综述 田山，董卫国审校

结直肠癌(CRC)是消化道最常见的恶性肿瘤，据国际癌症研究机构制定的GLOBOACAN 2018统计数值显示，CRC为全球第三大常见癌症，病死率仅次于肺癌，居癌症相关死亡原因第二位[1-2]。近年来，CRC在年轻人中的发病率逐渐攀升[3]，给社会带来了极大的经济和医疗负担。研究表明，早期诊断CRC及其癌前病变在提高5年生存率中起着重要作用[DukesA(T12N0M0)5年生存率93.2%,DukesC (T34N12M0)5年生存率47.7%][4]。因此，面向全民的CRC早期筛查，对CRC的防治至关重要。

根据美国癌症协会2018年新版指南，目前CRC的筛查主要包括以下6类项目：粪便免疫化学检测(FIT)、高敏感性隐血试验(HSgFOBT)、粪便DNA多靶点筛查、结肠镜检查、CT结肠成像、乙状结肠镜检查[5]。其中结肠镜检查是诊断CRC的金标准，但是由于操作时患者难以耐受及检查费用高，限制了该项检查的广泛应用[6]。FIT是目前应用最广泛的无创筛查方法，具有较好的特异度，但敏感度差异较大(61%～91%)，且坚持筛查的人数很少达到目标人群的70%[7]。近年来，检测挥发性有机化合物(VOC) 相关技术允许研究人员将挥发物与特定的病理生理变化联系起来[8-9],VOC检测作为一种新型肿瘤筛查方法受到关注，这为非侵入性早期CRC筛查提供了新思路，现就VOC检测技术与CRC中的临床应用研究进展综述如下。

1 VOC产生及检测方法概述

1.1 VOC的产生 按照世界卫生组织的定义，VOC是指沸点在50～260℃之间，室温下饱和蒸气压超过133.32 Pa的易挥发性有机化合物。人体散发出的VOC成分复杂，主要包括烷烃类、烯醇类、醛酮类、醇类、芳香族类等[10]。人体多种排泄物(呼出气体、尿液、粪便、汗水等)中均可检测到由感染、炎性反应、肿瘤疾病和外部因素(如药物、饮食或微生物组成的变化)引起的VOC改变[9]。 1971年，莱纳斯·鲍林(Linus Pauling)在人呼出气体中发现了上百种VOC，从而开启了研究人体VOC的大门。VOC可分为外源性和内源性两大类。其中外源性VOC占绝大多数，它们来源于外界环境，通过肺排泄至体外，不参与机体的代谢过程；而内源性VOC所占比例较少，为人体细胞代谢产物，经由血液到达肾小管上皮细胞、肺泡细胞、肠上皮细胞从而排出体外，其可直接反映体内组织细胞的代谢情况。

VOC产生和改变的机制主要包括3种。第一种是微生物的代谢改变，晚期腺瘤和CRC中常伴随肠道菌群紊乱，从而导致VOC成分的改变[11]。粪便中的VOC变化可反映肠道菌群的组成变化，Drees等[12]运用VOC分析技术可实现细菌感染早期快速诊断及感染细菌种类的识别，这为与微生物菌群失调有关的疾病中观察粪便VOC谱的差异提供了理论依据。Baxter等[13]在研究中观察到CRC患者中黏蛋白降解细菌——拟杆菌和阿克尔克氏菌有所增加，黏蛋白降解菌株的富集可导致游离氨基酸的积累。第二种是肿瘤细胞的异常代谢，肿瘤细胞的典型特征是单克隆失控性增殖及代谢异常，在恶性生长过程中发生基因突变和蛋白质的表达异常，产生大量的活性氧(ROS)导致细胞膜中的多不饱和脂肪酸被过度氧化，脂肪酸发生过氧化可生成乙烷和戊烷。此外，体内亦存在肿瘤细胞的凋亡和坏死，这些过程都可能产生特异性的代谢产物从而导致VOC的改变[14]。Batty等[15]对比健康人与高级别肠道上皮内瘤变患者的VOC后发现，由于肠道上皮内瘤变后细胞代谢的改变，VOC中硫化氢、二甲基硫和二甲基二硫化物比例明显增高。Sato等[16]研究表明，CRC导致的结肠炎性反应同时会在CRC细胞中激活自噬，导致游离氨基酸的释放。第三种是正常细胞的代谢改变，如氧化应激增加、分解代谢增加和免疫激活。在癌症危险因素的刺激下，氧化应激压力增加和细胞色素P450酶被诱导激活，正常细胞内ROS和氧自由基生成和失活平衡失调，进而导致ROS的产生增加，细胞中多不饱和脂肪酸和蛋白质发生反应，与此同时DNA、蛋白质都会发生过氧化，产生可被检测到的VOC差异[17]。

1.2 VOC检测方法 目前VOC检测主要有3种技术，3种检测技术的原理及特点对比说明，见表1。

1.2.1 气相色谱—质谱法(GC-MS)： GC-MS是成功用于综合分析VOC生物标志物化学表征的金标准平台[18]。该技术包括样品收集、样品预浓缩和样品分析3个操作步骤。不同的样品有不同的收集方法，若采集对象为呼出气体，则主要运用在线实时采样分析、气袋采样、CO2浓度监测采样方法；尿液、血液、粪便等样本的采样技术在相关文献均有报道；样品的预浓缩也是VOC检测中的一个重要环节，预浓缩利用多孔型材料的物理吸附能力，在样品流过富集材料时，通过提升温度使吸附样品迅速脱附并进入分析系统[19]，以达到富集样品中痕量VOC的目的。样品进入分析系统后，GC-MS可以将样本中的可挥发分子进行分离，并且同时对样本进行性质和量化的检测。由于GC-MS技术可以鉴定样品的具体组成成分，进而提供关于样品组成的定性和定量信息，因此可将CRC患者与健康对照组进行代谢特征对比，从而寻找有意义的生物学标志物差异。该技术具有高效的优点，但因其高成本限制了其在临床中推广应用。

1.2.2 选择性离子流管质谱法(SIFT-MS)： 是一种定量选择质谱技术，可以实时测量潮湿空气样品中微量气体分子的浓度。该技术的原理是质谱法与选择离子流管耦合，基于微波放电产生的前体离子(H3O+，NO+和O2+)诱导化学电离并由四极质谱仪进行选择。首先使用四极质谱法选择它们的分析顺序，以微波放电产生前体离子，然后以预定的顺序用前体离子诱导化学电离反应，对待分析样品中的VOC进行电离分析。分析过程中前体离子和VOC在流管中相互作用并进入第二个四极质谱仪，通过扫描研究者定义的特定质荷比(m/z)值范围来完成实时数据分析，并且可以根据前体和产物离子信号比率实时计算微量化合物的绝对浓度[20]。与GC-MS相比，因该技术分离的VOC较少，所以提供的关于VOC组成详细信息较GC-MS少，不能确定分子种类。但该技术无需样品预处理或标准混合物校准，具有实时测量，较低的维护成本，无需专业人员操作的优点[21]。

表1 各种VOC检测技术及特点概览

注：GC-MS.气相色谱-质谱法；SIFT-MS.选择性离子流管质谱法；eNose.电子鼻

1.2.3 电子鼻技术(electronic-nose technology,eNose):eNose技术源于犬类嗅觉，eNose技术不能识别单个VOC，但它可以检测到不同化学类别(如烷烃、醇类和芳香族化合物)的组合。目前有不同种类的商用和定制eNose，各包含6～32个传感器阵列，虽然其装置多种多样，但均有基于模式识别的共同点。E-Nose技术以使用模式识别的方式来识别特定状态，具有操作简便、测量速度快且低成本的优点。该技术的缺点是无法提供绝对校准和计量资料，影响电子鼻在临床工作中的运用。

1.2.4 其他分析方法： Mozdiak等[22]首次运用气相色谱—离子迁移率光谱法(GC-IMS)联合非对称场离子迁移率光谱法(FAIMS)分析CRC患者尿液标本中的VOC，结果显示，与粪便隐血试验(FOBT)相比，该方法具有更高的测试准确性和更高的敏感度，ROC曲线下面积(AUC)达98%(目前该方法在VOC检测中的研究和应用较少)。

2 VOC在CRC早期诊断中的应用

2.1 尿液中VOC在CRC早期诊断中的应用 尿液中代谢产物浓度高、易收集的特点使其成为研究CRC中VOC良好的实验标本。Silva等[23]用GC-MS法对比了33例癌症患者(包括白血病14例，CRC患者12例和淋巴瘤患者7例)和21例健康人尿液标本中82种VOC成分，结果表明，有18种VOC成分在2组间存在显著差异，包括己醛、2-甲基-3-苯基-2-丙烯醛(+)、对异丙基苯(+)、苯甲醚(+)、4-甲基苯酚(+)、1,2-二氢-1,1,6-三甲基萘(+)等，首次将尿液标本VOC检测应用于CRC诊断的研究。Westenbrink等[24]收集了39例CRC患者、35例肠易激综合征患者及18例健康人的尿液标本进行VOC分析，结果发现VOC筛查CRC的敏感度和特异度分别为78%、79%。Arasaradnam等[25]分析83例CRC患者与50例健康人尿液标本中的VOC，该研究中VOC分析诊断CRC的敏感度和特异度分别为88%、60%。

2.2 粪便中VOC在CRC早期诊断中的应用 粪便作为直接反映肠道菌群改变及肠道细胞代谢改变的人体排泄物，同样也具有研究价值[26]。De Meji等[27]利用eNose技术首次分析粪便标本中的VOC，通过检测157例试验对象(40例CRC患者，60例晚期腺瘤，57例健康人)的粪便标本，发现CRC患者粪便标本中的VOC成分与健康人存在显著差异；该方法对CRC和晚期腺瘤诊断的敏感度分别为85%和62%，特异度分别为87%和86%，并且具有良好的重复性。试验中FIT检测对CRC和晚期腺瘤诊断的特异度均为100%，敏感度分别为63%和7%。 SIFT-MS技术同样可用于检测粪便样品中的VOC，并且已经在相关研究中应用[15]。Bond等[28]对137例试验对象(60例健康对照者，56例腺瘤性息肉患者，21例结直肠癌患者)粪便中162种VOC成分进行检测，丙-2-醇的浓度在癌症组患者中明显升高，差异具有统计学意义(P<0.01), 丙-2-醇作为标志物预测CRC的AUC为0.76。当联合3-甲基丁酸作为诊断标志物时，AUC可达0.82，敏感度和特异度分别为87.9%和84.6%。结果表明VOC检测较英国目前临床应用的CRC粪便生物标志物检测具有更高的准确性。

2.3 血液/血清中VOC在CRC早期诊断中的应用 呼出气体中VOC检测的准确性容易受到肺部疾病、吸烟、饮食、环境暴露等因素的影响[29]。血浆作为循环全身的内环境，机体对包括肿瘤在内的各种刺激所产生的VOC改变在进入呼出气体前可首先体现在血液中。检测血液/血清生物标志是筛查、诊断疾病应用已久的经典方法。代谢组学和检测技术的发展使得检测血液/血清中VOC用于疾病诊断成为可能。Wang等[30]研究了36例试验对象(16例CRC患者，20例健康人)血液标本中VOC成分的改变，基于GC-MS研究发现，CRC患者血液中3种VOC(苯基甲基氨基甲酸酯，乙基己醇和6-叔丁基-2,2,9,9-四甲基-3,5-癸二烯-7-炔)的含量显著降低(P<0.01)，1种(1,4,4-四甲基-2,5-二甲基-环己烷)显著升高(P<0.05)。

2.4 呼出气体VOC在CRC早期诊断中的应用 呼出气体对于疾病的诊断价值早已被证实[31]，近年来国外研究发现，呼出气体VOC检测在乳腺癌、肺癌、胃癌等肿瘤的诊断中具有重要临床意义[32-34]。国内研究主要集中在VOC检测对于肺部疾病的诊断，研究证实该技术在肺癌、慢性阻塞性肺疾病及下呼吸道感染病原菌的诊断中具有临床意义[35-37]。Amal等[38]研究表明，丙酮和乙酸乙酯的浓度在CRC组中升高，呼出气体VOC检测诊断CRC的敏感度、特异度和准确性可分别达到85%、94%和91%。Marker等[39]对150例研究对象(100例健康对照组，50例CRC患者)进行呼出气体的VOC检测，试验发现丙醛可作为特异性VOC标志物，其对CRC诊断的敏感度和特异度分别为96%和76%，对CRC复发诊断的敏感度和特异度为71.4%和90.9%。这些研究证明了呼出气体VOC检测对CRC早期筛查及监测复发的重要意义。

3 VOC研究方向展望

3.1 VOC分析的方法学标准化 尽量避免因方法学的差异而产生偏差，同时也需要对最佳检测条件(如样本的选择、样本的温度、湿度、pH等)进行摸索，以减少检测误差，提高可重复性。VOC生物样品的选择需考虑操作的简便性、样本的可及性、患者的依从性及经济成本等，对于提高患者筛查率至关重要。

3.2 VOC检测技术的改进和创新 在癌症筛查计划中，筛查手段的性价比具有重要意义。目前VOC检测的平均费用是FIT的数十倍，同样高于结肠镜的检查价格。高昂的检测费用及对仪器设备的要求使VOC检测较难被接受，因此目前国内尚无关于CRC诊断方面的VOC研究。因此，便捷、低廉的仪器开发将会更快推动VOC检测在CRC诊断上的应用。

3.3 VOC检测肿瘤标志物的统一性 目前对CRC筛查尚无统一的VOC标志物，寻找特异度和敏感度较高的VOC肿瘤生物标志物成为研究的关键。多项研究数据证明，VOC与疾病之间的关系常反映在某一类别VOC，主要为饱和烃类(烷烃)、不饱和烃类、含氧类有机化合物、含硫类有机化合物和含氮类有机化合物，而非单独某一种VOC。但是由于学者在考察VOC检测对CRC的诊断作用时所用标本不同，仪器设备不同，统计学方法不同等，导致分析结果不尽相同。所以尚需更全面地开展临床研究，收集足够数据来确定统一的VOC肿瘤标志物。

3.4 VOC检测对于治疗和预后评估的作用 目前国内外VOC检测多用于疾病的诊断与鉴别诊断，关于VOC检测与药物治疗效果及预后之间的关系研究较少，这也是VOC检测需要进一步研究的方向。

4 小 结

CRC的早期筛查对于改善患者预后具有重要意义。理想的CRC筛选方法应具有较好的依从性、敏感性和特异性，以及微创性和经济性。作为一种新型的CRC筛查方式，VOC具有创伤小或无创伤、依从性高、准确性高等优点。同时，VOC筛查手段的发展仍面临诸如检测费用高、操作流程未标准化、肿瘤标志物未统一化等挑战。但随着该领域学者不懈努力及代谢组学技术不断发展，人们防癌意识的提高，VOC检测技术有望成为CRC筛查及早期诊断的重要辅助手段。