Berthelot比色法测定γ-氨基丁酸含量的实验条件优化

闫朝阳，李 旭，马钰柯，金凯旋，王元秀

(济南大学 生物科学与技术学院，山东 济南 250022)

γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid，GABA)是一种天然的非蛋白质氨基酸，广泛存在于动、植物和微生物中[1]。在哺乳动物体内，GABA作为重要的抑制性神经递质[2]，参与多种代谢活动，具有多种功效[3-4]，因此与之相关的研究成果很多。

GABA的检测方法主要有高效液相色谱(HPLC)法、Berthelot比色法、纸电泳法、纸层析法、氨基酸分析法等[5-10]。国家标准中规定的GABA检测方法是HPLC法，主要是利用邻苯二甲醛与GABA发生柱前衍生反应，再利用紫外反相HPLC来测定GABA的含量。HPLC法的检测精度、准确度都很高，但检测过程繁琐、费时，不适合大批量GABA样品的检测[11-12]。Berthelot比色法是利用苯酚(C6H5OH)和次氯酸钠(NaClO)与GABA的游离氨发生显色反应来检测GABA的含量，检测的灵敏度较高，简单易行，可快速检测大批量GABA样品[13-14]。相比之下，纸电泳法、纸层析法测定GABA含量的准确度太低[15-17]，氨基酸分析法与HPLC法优、缺点类似[18-19]，所以，Berthelot比色法是检测GABA含量最方便、快捷、易操作的方法[20-21]。李秀娟等[22]对Berthelot比色法中苯酚、次氯酸钠的用量进行了优化，但未对加热温度、沸水浴时间、冰浴时间等因素进行研究。赵国群等[23]尝试建立一种快速测定GABA浓度的方法，利用乙醛酸、琥珀酸和溴甲酚绿能够与GABA的游离氨发生显色反应的原理，制成了由不同浓度的乙醛酸、琥珀酸、溴甲酚绿组成的混合显色剂，在波长为617 nm处检测GABA的浓度，但所使用的显色剂毒性很大，且检测精度较低。本文中通过显色剂的组成含量、加热时间、加热温度、冰浴时间的单因素与响应面实验优化Berthelot比色法，并将优化后的Berthelot比色法测定结果与HPLC法的测定结果进行t检验，比较二者数据的差异性。

1 实验材料与仪器

1.1 实验试剂

实验所用试剂包括：γ-氨基丁酸(GABA)，分析纯，上海麦克林生化科技有限公司；苯酚(C6H5OH)，分析纯，天津大茂化学试剂厂；次氯酸钠(NaClO)，分析纯，天津市科密欧试剂有限公司；硼酸(H3BO3)，分析纯，天津大茂化学试剂厂；乙醇(C2H5OH)，分析纯，浙江中山化工集团有限公司；邻苯二甲醛(OPA)，分析纯，天津市科密欧试剂有限公司；乙腈(C2H3N)，色谱纯，天津大茂化学试剂厂；乙酸钠(CH3COONa)，分析纯，天津大茂化学试剂厂；甲醇(CH3OH)，色谱纯，天津大茂化学试剂厂；巯基乙醇(C2H6OS)，分析纯，天津市科密欧试剂有限公司。

1.2 实验仪器

实验所需仪器包括：UV2600型紫外可见分光光度计，日本岛津公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海百典仪器有限公司；PHS-3B型酸度计，上海雷磁仪器厂；YP2102型电子天平，上海光正医疗仪器有限公司；FA1104型分析天平，上海精科实业有限公司；Therm-3000型高效液相色谱仪，美国赛默飞公司。

2 实验方法

2.1 GABA样品溶液的配制

用分析天平准确称取3.00 mg的GABA样品，溶解后倒入100 mL容量瓶中定容，4 ℃下避光保存，作为GABA的待测样品溶液。

2.2 HPLC法测定[11-12]

2.2.1 GABA标准溶液的配制

准确称取1 mg的GABA标准样品，配制成质量浓度为0.1 g/L的GABA标准溶液，在4 ℃下避光保存。应用时将该溶液稀释至设定的浓度，将稀释溶液过0.22 μm微孔滤膜后，在4 ℃下避光保存。

2.2.2 衍生剂的配制

向1 mL乙腈中加入0.1 mg OPA，溶解后再加入130 μL的C2H6OS，用浓度为0.4 mol/L的H3BO3缓冲溶液至10 mL容量瓶定容；将该溶液过0.22 μL微孔滤膜，4 ℃下避光保存。

2.2.3 柱前衍生反应

取500 μL的GABA稀释液，加入50 μL OPA衍生剂，振荡后静置10 s，然后将该溶液过0.22 μm微孔滤膜后进样。

2.2.4 色谱条件

色谱柱采用C18柱。

流动相A为质量分数为0.8%、pH为(7.2±0.2)的乙酸钠溶液。流动相B为质量分数为0.8%、pH为(7.2±0.2)的乙酸钠溶液、乙腈、甲醇(三者体积比为1 ∶2 ∶2)混合后过滤备用。梯度洗脱顺序见表1。

表1 色谱流动相梯度洗脱表

以GABA稀释液的响应峰面积为纵坐标、质量浓度为横坐标制作标准曲线。

2.2.5 GABA样品的测定

取GABA样品溶液过0.22 μm微孔滤膜后进样，按照设置的色谱条件进行梯度洗脱，重复14次，得到HPLC法测试数据。

2.3 Berthelot比色法测定

2.3.1 标准曲线的绘制

将配制的GABA标准溶液稀释至质量浓度分别为0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06 g/L，然后各取0.5 mL加入pH为9.0、浓度为0.2 mol/L的H3BO3缓冲液0.2 mL, 质量分数为6%的C6H5OH溶液1 mL和质量分数为7%的NaClO溶液0.4 mL，充分振荡后沸水浴加热10 min，之后迅速在冰水浴中冷却20 min，待出现蓝绿色后再加入体积分数60%的乙醇溶液2 mL，以GABA标准溶液为空白对照组，在波长为630 nm处测定吸光度(OD)。以测定的OD值为纵坐标，GABA标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线[24]。之后检测GABA样品溶液14次，并记录实验数据。

采用t检验验证2种方法的测定结果是否具有显著性差异，比较测试数据的标准差、方差、平均值。

2.4 Berthelot比色法反应条件的优化

为了避免溶液体积变化对实验结果的影响，选用相同体积、不同浓度的C6H5OH、NaClO、乙醇溶液来探究显色剂组成含量对比色反应的影响，并且以GABA溶液的平均OD值作为优化实验的对照。

2.4.1 单因素实验

采用单因素实验[25-27]研究了C6H5OH质量分数分别为3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%，NaClO质量分数分别为4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%，乙醇体积分数分别为40%、50%、60%、70%、80%、90%、100%，加热温度分别为65、70、75、80、90、95、100 ℃，加热时间分别为4、6、8、10、12、14、16 min，冰浴时间分别为5、10、15、20、25、30、35 min等实验条件对Berthelot比色法显色反应的影响。

2.4.2 响应面优化实验

根据单因素实验的结果，通过Plackett-Burman实验，确定了加热温度、加热时间、冰浴时间3个因素对比色反应的影响较为显著，所以选择这3个因素，利用软件Design-Expert 8.0，进行Box-Benhnken实验设计，其因素水平见表2。

表2 Box-Benhnken实验因素水平表

采用t检验验证优化后Berthelot比色法与HPLC法检测数据是否具有显著性差异，比较测定结果的标准差、方差、平均值。

3 结果分析

3.1 HPLC法检测结果

HPLC法测定GABA含量的标准曲线如图1所示，标准曲线方程为y=428.71x+0.927(相关系数的平方r2=0.999)。测试数据见表3。经过计算，用HPLC法测试得到的γ-氨基丁酸的质量浓度的平均值为0.029 5 g/L，方差为1.277×10-6g2/L2，标准差为0.003 53 g/L，相对标准偏差(RSD)为1.22%。

图1 高效液相色谱法测定γ-氨基丁酸含量的标准曲线

表3 高效液相色谱法测定γ-氨基丁酸数据

3.2 未优化的Berthelot比色法检测结果

3.2.1 标准曲线

未优化的Berthelot比色法测定GABA含量的标准曲线见图2。标准曲线方程为y=3.99x-0.021 5(r2=0.992)。测试数据见表4。经过计算，该法测定的GABA质量浓度的平均值为0.030 2 g/L； 方差为2.290×10-6g2/L2，标准差为0.001 13 g/L，RSD为3.74%。

图2 未优化的Berthelot比色法测定γ-氨基丁酸含量的标准曲线

表4 未优化的Berthelot比色法测定γ-氨基丁酸数据

该组数据的平均OD值为0.99，作为优化实验的对照OD值。

3.2.2 HPLC法和未优化的Berthelot比色法数据的比较

首先对HPLC法和未优化的Berthelot比色法测定的结果进行t检验。假设H0，2组数据存在显著性差异，进行t检验，显著性水平P值为0.551，远远大于0.05，拒绝H0，因此2组数据不存在显著性差异，同时2组数据的质量浓度平均值、标准差、方差相近，说明数据的差异较小。

3.3 单因素实验优化实验

3.3.1 显色剂中C6H5OH含量对OD的影响

图3 显色剂中苯酚含量对吸光度的影响

显色剂中C6H5OH含量对OD的影响如图3所示。由图可知，随着C6H5OH含量的增大，GABA溶液的OD值增大，C6H5OH质量分数为6%时对应的OD值与0.99相近，因此确定C6H5OH的质量分数6%。

3.3.2 显色剂中NaClO对OD的影响

显色剂中NaClO含量对OD的影响如图4所示。由图可知，随着NaClO含量的增大，GABA溶液的OD值增大，NaClO质量分数为7%时对应的OD值与0.99相近，由此确定NaClO的质量分数7%。

图4 显色剂中次氯酸钠含量对吸光度的影响

3.3.3 显色剂中乙醇含量对OD的影响

显色剂中乙醇含量对OD的影响如图5所示。由图可知，随着乙醇含量的增大，GABA溶液的OD值在0.09～0.10之间波动变化，乙醇体积分数为60%时其OD值与0.99相近，由此确定乙醇体积分数60%。

图5 显色剂中乙醇含量对吸光度的影响

3.3.4 加热温度对OD的影响

加热温度对OD的影响如图6所示。由图可知，随着加热温度的升高，GABA溶液的OD值先增大，后趋于平稳，当温度为90～100 ℃时，其OD值与0.99相近，由此确定最低加热温度为90 ℃。

图6 加热温度对吸光度的影响

3.3.5 加热时间对OD的影响

加热时间对OD的影响如图7所示。由图可知，随着加热时间的延长，GABA溶液的OD值先增大后减小，加热时间为6～10 min时其OD值与0.99相近，由此确定最短加热时间为6 min。

3.3.6 冰浴时间对OD的影响

冰浴时间对OD的影响如图8所示。由图可看出，随着冰浴时间的延长，GABA溶液的OD值先增大后平缓，之后又减小，冰浴时间为10～25 min时其OD值与0.99相近，由此确定最短冰浴时间为10 min。

3.4 响应面实验结果

响应面优化实验共设计了如表5所示的17个子实验，中心试验进行5次，用来估计实验的误差，其余的实验点均为析因点。具体设计组合及实验结果见表5。

图8 冰浴时间对吸光度的影响

表5 响应面实验设计及结果

3.4.1 数据分析

采用Design-Expert软件对所得数据进行回归分析，然后对数据进行多元回归拟合，获得加热温度T、加热时间t1、冰浴时间t2的二次多项回归方程为

式中IOD为吸光度。

由回归方程的方差分析可知，比色反应所得到的二次多项回归方程的相关系数的平方r2=0.998，数值接近1，表明拟合良好，实验误差较小。该模型的P<0.000 4，说明模型的显著性非常明显，实验可行； 同时失拟项的P=0.966远大于0.100 0，构建的响应面模型失拟不显著，能够很好地描述比色反应中反应温度、加热时间、冰浴时间与OD的关系。当模型的有效信号与噪声的比值(RSN)大于4.00时即视为合理，本文中构建模型的RSN为11.899，说明模型预测作用较好。在响应面模型中，根据P值的大小，综合各水平可以得出结论，即响应面中3个水平因素对OD的影响由大到小的顺序为加热温度、加热时间及冰浴时间。

3.4.2 响应面立体图分析

对回归方程方差进行分析，利用Design-Expert软件画出加热时间、加热温度、冰浴时间对比色反应OD影响的响应面图(见图9—11)，分析2个因素之间的交互作用对比色反应OD的影响。比较各组响应面及等高线可知，提取率所选范围内存在的极值就是响应面的最高点，同时也是等高线椭圆的中心，同时利用等高线的形状来反映各组条件交互作用强弱，等高线越趋向椭圆表示交互作用越强，越趋向圆形表示交互作用越弱。

图9 加热时间和加热温度对吸光度的交互影响曲面图

图10 冰浴时间和加热温度对吸光度的交互影响曲面图

图11 冰浴时间和加热时间对吸光度的交互影响曲面图

在加热时间与加热温度之间的交互作用中，等高线为椭圆形，表明二者的交互作用较强。当加热温度为98.04 ℃、加热时间为6.44 min时，OD达到最大值，其中沿加热时间方向的等高线密度大于沿加热温度方向的，说明加热时间对OD的影响较大。在冰浴时间与加热温度之间的交互作用中，等高线为椭圆形，表明二者的交互作用较强。当加热温度为98.04 ℃、冰浴时间为8.72 min时，OD达到最大值，其中沿冰浴时间方向的等高线密度大于沿加热温度方向的，说明冰浴时间对OD的影响较大。在冰浴时间与加热时间之间的交互作用中，等高线为椭圆形，表明二者的交互作用较强。当加热时间为6.44 min、冰浴时间为8.72 min时，OD达到最大值，其中沿冰浴时间方向的等高线密度大于沿加热时间方向的，说明冰浴时间对OD的影响较大。

3.4.3 验证实验

根据Design-Expert软件优化，得到的最佳测试条件是： 初始加热温度为98.04 ℃，加热时间为6.44 min，冰浴时间为8.72 min，此时理论OD值为0.100。

为了验证方法的可靠性，同时又考虑实际操作的方便，本文中选取加热温度为98 ℃，加热时间为7 min，冰浴时间为9 min进行验证实验，共进行3组平行试验，获得的比色反应OD值为0.99，与预测值相比较仅小1.00%，说明优化条件可行。

3.4.4 优化后Berthelot比色法与HPLC法测定结果的比较

优化后Berthelot比色法测定GABA含量的标准曲线见图12，标准曲线方程为y=4.04x-0.017 8(r2=0.995)。测试数据见表6。由表中数据可知，采用优化后Berthelot比色法测定GABA质量浓度的平均值为0.029 4 g/L，方差为5.436×10-7g2/L2；标准差为0.000 738 g/L，RSD为2.48%。

图12 优化后Berthelot比色法测定γ-氨基丁酸含量的标准曲线

表6 优化后Berthelot法检测γ-氨基丁酸浓度数据

对HPLC法和优化后Berthelot比色法测定结果进行t检验验证。P=0.807 6，远远大于0.05，表明2组数据不存在显著性差异，同时优化后Berthelot比色法的质量浓度平均值、标准差、方差与HPLC法的t检验值更加接近。

优化后的Berthelot比色法相比于未优化方法RSD值减小了1.26%，说明优化后的方法的检测结果相对标准偏差更小，稳定性、重复性更好。

4 结论

优化后的Berthelot比色法与未优化的方法相比，显色反应时间缩短了46%，RSD值减小了1.26%，稳定性、重复性更好，更加简便快捷，并且与HPLC法无显著性差异，是一种方便、简洁、准确的GABA含量检测方法。